RNA-seq | 转录组标准分析流程和常用工具软件介绍

笔记内容摘要：RNA-seq转录组基础知识与标准分析流程，简单记录学习过程。

转录组分析是对样本转录产物RNA的深入挖掘研究。通常情况下，植物的表型差异可能由许多因素控制，其中包括基因的转录环节，不同基因的转录情况有所不同，可能会使表型发生变化。

差异表达分析是对mRNA测序后获得表达矩阵，研究不同基因的表达量差异，除此之外，还有功能富集分析、联合分析等多种手段。

转录组分析标准流程

数据准备

• 测序数据

测序数据：fastq格式的文件（由测序公司提供），每4行为一个reads。

• 数据信息

样本信息表：每行是一个样本，每列是一个性状表型。

基因信息表：每行是一个基因、每列是一个信息，信息为注释所得。

• 参考基因组

1.基因组序列.fastq
2.基因注释.gtf

这一部分是前期数据准备的过程，通过测序或者数据库获取原始数据，用于后续的分析流程。

比对到参考基因组

• 操作步骤
  1.构建参考基因组
  2.序列比对
  3.压缩和排序
  4.建立索引 bam index

• 输出文件
  对比结果.bam 利用IGV可视化对比软件能够打开bam文件进行查看。

定量表达

• 操作步骤
  htseq htseq-count
  subread（rsubread）

利用上述软件实现单个样本表达量的计算，另外还可以将count格式转化为FPKM格式，之后用于R语言进一步绘图使用。

• 输出文件
  定量结果.count

表达矩阵

表达矩阵的每一行是一个基因，每一列是一个样本。

• 操作步骤
  1.counts 矩阵
  2.TPM 矩阵
  3.TPM+TMM 矩阵

上述步骤是进行数据的标准化和处理，构建合适的表达矩阵，TPM和TMM是不同的矫正方法，形成如下的数据格式

差异表达分析

• 操作步骤

1.DESeq2
有生物学重复时使用。用于寻找组间显著表达变化的基因，DESeq2主要使用负二项分布的模型来进行差异分析。

2.edgeR

无生物学重复时使用。edgeR是一个研究重复计数数据差异表达的Bioconductor软件包。基于负二项分布的统计方法，包括经验贝叶斯估计、精确检验、广义线性模型和准似然检验。

后续还可以进行KEGG，GSEA，GO富集分析

转录组数据分析所需软件列表：
质控
fastqc , multiqc, trimmomatic, cutadapt ,trim-galore
比对
star, hisat2, bowtie2, tophat, bwa, subread
计数
htseq, bedtools, deeptools, salmon

参考资料：
https://www.genek.cn
https://blog.csdn.net/bio_meimei/article/details/109458283
https://blog.csdn.net/qq_28723681/article/details/124914014
https://blog.csdn.net/weixin_45536936/article/details/126026764

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