甲基化测序技术及其在老年疾病和衰老模型中的应用
一、甲基化测序技术
1、12种DNA甲基化测序技术
1）什么是DNA的甲基化呢？
DNA甲基化是指针对DNA序列上的CpG岛，由甲基化转移酶将S腺苷甲硫氨酸的甲基转移给胞嘧啶。其中，5’甲基胞嘧啶(5mC) 的甲基化是一个非常重要的表观遗传学修饰事件，该事件能够调控基因活性，并影响着如细胞分化、转录调控和染色质重塑等生物学过程。
2）什么是DNA甲基化测序？
随着下一代测序技术（NGS）技术的发展，使我们能够从全基因组水平来分析5’甲基胞嘧啶及组蛋白修饰等事件，由此能够发现很多传统的基因组学研究所不能发现的东西。
3）DNA甲基化测序方法按原理可以分成三大类：
(a)重亚硫酸盐测序；
(b)基于限制性内切酶的测序；
(c)靶向富集甲基化位点测序；
(d)采用动力学原理来直接检测甲基化的胞嘧啶测序；
4）基于以上原理又有数种不同的测序方法，下面，介绍12种DNA甲基化测序的常用方法及参考文献：
(a)重亚硫酸盐测序
该方法可以从单个碱基水平分析基因组中甲基化的胞嘧啶。首先，利用重烟硫酸盐对基因组DNA进行处理，将未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基变成尿嘧啶。而发生了甲基化的胞嘧啶未发生脱氨基，因而，可以基于此将经重亚硫酸盐处理的和未处理的测序样本进行比较来发现甲基化的位点。
【相关文献】Shotgun bisulphite sequencing of the Arabidopsis genome reveals DNA methylation patterning Highly integrated single-base resolution maps of the epigenome in Arabidopsis
(b)重亚硫酸盐处理后接头标记技术(PBAT)
为了避免重亚硫酸盐处理时模板的丢失，通常会在重亚硫酸盐处理后进行接头连接和随机引物的扩增。
【相关文献】Amplification-free whole-genome bisulfite sequencing by post-bisulfite adaptor tagging
(c)限制性内切酶-重亚硫酸盐靶向测序(RRBS)
该技术是指对基因组上CpG岛或CpG甲基化较密集的区域进行靶向测序。样本首先经几种限制酶进行消化处理，然后经重亚硫酸盐处理，最后再测序。这种方法可以发现单个核苷酸水平的甲基化。
【相关文献】Reduced representation bisulfite sequencing for comparative high-resolution DNA methylation analysis
(d)氧化-重亚硫酸盐测序(oxBS-Seq)
5’羟甲基胞嘧啶(5’hmC)是5’甲基胞嘧啶脱甲基成胞嘧啶过程的中间产物，重亚硫酸盐测序无法对二者进行区分。通过氧化-重亚硫酸盐测序，5’甲基胞嘧啶保留，而5’羟甲基胞嘧啶(5’hmC)被氧化，进而脱氨基成尿嘧啶。通过将经过氧化处理和未处理的样本进行测序比较，即可从单个碱基水平分辨5’羟甲基胞嘧啶(5’hmC)和5’甲基胞嘧啶。
【相关文献】Quantitative sequencing of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at single-base resolution
(c)TET辅助的重亚硫酸盐测序(TAB-seq)
TAB-seq采用葡萄糖亚胺与5’羟甲基胞嘧啶(5’hmC)作用来保护免受TET蛋白的氧化。5’甲基胞嘧啶和未甲基化的胞嘧啶被脱氨基成尿嘧啶，进而可以从单个碱基水平鉴定5’羟甲基胞嘧啶(5’hmC)。
【相关文献】Base-resolution analysis of 5-hydroxymethylcytosine in the Mammalian genome
(e)甲基化敏感性的限制酶测序(MRE-Seq)
MRE-Seq将甲基化作用的敏感性和限制酶的特异性结合起来进而鉴定CpG岛的甲基化状态。
【相关文献】Genome-scale DNA methylation analysis
(f)HELP-Seq
HELP-Seq采用HpaII及其甲基化不敏感的限制性内切酶MSPI处理，来对基因组内及基因组间的甲基化位点进行比较，进而实现甲基化测序。
【相关文献】Comparative isoschizomer profiling of cytosine methylation: the HELP assay
(g)甲基化DNA免疫共沉淀测序(MeDIP)
MeDIP是一种采用抗体或甲基化DNA结合蛋白来捕获富集甲基化DNA的技术，这种技术可以发现基因组中高度甲基化的区域，如CpG岛，但不能进行单个碱基水平的分析。
【相关文献】Chromosome-wide and promoter-specific analyses identify sites of differential DNA methylation in normal and transformed human cells
(h)羟甲基化DNA免疫共沉淀测序(hMeDIP)
(i)j甲基化DNA染色质免疫共沉淀测序（ChIP）
(g)甲基化结合域捕获技术(MBD-CAP)
MBD-CAP技术利用甲基化DNA能够结合蛋白MeCP2, MBD1-2 和 MBD3LI来对甲基化的DNA进行免疫沉淀。与MeDIP技术相似，该技术也是可以发现基因组中高度甲基化的区域，不能从单个碱基水平分析甲基化。
【相关文献】High-resolution mapping of DNA hypermethylation and hypomethylation in lung cancer
(k)基于探针的靶向富集技术
甲基化测序靶向富集技术采用合成寡核苷酸探针来捕获CpG岛、基因启动子区域以及其他一些显著性甲基化的区域。目前，Agilent 和 Roche Nimblegen公司已有这种商品化的试剂盒。
(l)单分子试实时（SMRT）DNA测序技术。
Pacific Biosciences公司的这项SMRT DNA测序技术采用动力学原理来直接检测甲基化的胞嘧啶。与上述提到的其他技术不同，这种技术不需要用到限制酶或重亚硫酸盐试剂。
2、RNA甲基化测序技术
3、组蛋白甲基化测序技术
4、转录因子甲基化测序技术
参考：http://www.biomart.cn/news/16/149588.htm
二、甲基化测序技术与老年疾病
1、老年糖尿病肾病患者转化生长因子β1基因表达调控区甲基化改变及机制；
参考：http://xueshu.baidu.com/s?wd=paperuri：(74db4ea8824f36bb38fa7c2e985cbb90)&filter=sc_long_sign&sc_ks_para=q%3D%E8%80%81%E5%B9%B4%E7%B3%96%E5%B0%BF%E7%97%85%E8%82%BE%E7%97%85%E6%82%A3%E8%80%85%E8%BD%AC%E5%8C%96%E7%94%9F%E9%95%BF%E5%9B%A0%E5%AD%90%CE%B21%E5%9F%BA%E5%9B%A0%E8%A1%A8%E8%BE%BE%E8%B0%83%E6%8E%A7%E5%8C%BA%E7%94%B2%E5%9F%BA%E5%8C%96%E6%94%B9%E5%8F%98%E5%8F%8A%E6%9C%BA%E5%88%B6&tn=SE_baiduxueshu_c1gjeupa&ie=utf-8&sc_us=1774453518799272595
2、闽南地区住院患者脑白质疏松症的流行病学调查及基于DNA甲基化的静观遗传学研究
参考：http://xueshu.baidu.com/s?wd=paperuri%3A%28fc0336c3e0cb6ca6707aa058a1de306f%29&filter=sc_long_sign&sc_ks_para=q%3D%E9%97%BD%E5%8D%97%E5%9C%B0%E5%8C%BA%E4%BD%8F%E9%99%A2%E6%82%A3%E8%80%85%E8%84%91%E7%99%BD%E8%B4%A8%E7%96%8F%E6%9D%BE%E7%97%87%E7%9A%84%E6%B5%81%E8%A1%8C%E7%97%85%E5%AD%A6%E8%B0%83%E6%9F%A5%E5%8F%8A%E5%9F%BA%E4%BA%8EDNA%E7%94%B2%E5%9F%BA%E5%8C%96%E7%9A%84%E9%9D%99%E8%A7%82%E9%81%97%E4%BC%A0%E5%AD%A6%E7%A0%94%E7%A9%B6&sc_us=4337306961110480163&tn=SE_baiduxueshu_c1gjeupa&ie=utf-8
三、甲基化测序技术与衰老
1、甲基化与衰老研究概述
已经建立起了通过检测细胞的DNA甲基化水平来推测机体的生理年龄及死亡率的模型，并且发现了一些组蛋白甲基化调节衰老的直接证据等。
1）甲基化与衰老研究的进展
(a)DNA甲基化与衰老研究的进展（亦可，参考http://www.docin.com/p-1253429367.html）
(b) 组蛋白甲基化与衰老研究的进展
2）引起衰老过程中甲基化水平异常变化的各种因素
(a)衰老过程中与甲基化水平相关的各种生理变化
(b)衰老过程中与甲基化水平相关的基因及通路
(c)衰老过程相关甲基化水平的改变与已知衰老相关风险因子的关系
参考：http://www.lifeomics.com/?p=35047
2、一个衰老模型，即表观基因组的微小变化，比如DNA甲基化状态，会随着时间推移而积累，并且导致基因表达和细胞功能更广泛的变化。
全基因组甲基化测序（WGBS），比较了一位103岁老年男性和一名新生男婴的DNA样本，从中分析了表观遗传修饰模式的差异。百岁老人的DNA甲基化区域比新生儿少50多万个位点，DNA甲基化水平降低了7%。这种甲基化水平的差异出现在基因组所有区域，包括启动子，外显子区域，内含子区域以及基因间区。这表明新生儿与百岁老人之间存在着基因表达模式的差异。此外，对26岁的青年人基因组分析表明，青年人DNA甲基化水平则介于两个极端年龄之间。
科研人员发现遗传因素对长寿仅起了10%的作用，而环境因素则起了90%的作用。表观遗传修饰，比如胞嘧啶甲基化，正是对环境刺激做出的一种的反应。本研究是首次从单核苷酸水平对新生儿和百岁老人的全部甲基化情况进行研究，为深入了解人类衰老、长寿及其他相关的疾病（如癌症）提供了重要的思路。作为一种程序化衰老机制，DNA甲基化的积累效应或许可以成为衡量生命衰老进程的关键标记。
参考：http://www.genomics.cn/news/show_news?nid=99104
