易基因：Genome Biol/IF10.1：WGBS等揭示生菜驯化和分化过程中的DNA甲基化变异机制

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生菜（Lactuca sativa L.，莴苣属）是世界范围内重要的菊科（Asteraceae）蔬菜作物，全球广泛种植，也是人类植物营养素的重要来源。现代生菜品种根据形态特征被分为多个不同的园艺类型，包括奶油生菜、脆叶生菜、 cos（也称为罗马生菜）、散叶生菜、拉丁生菜、茎用生菜和油籽生菜。尽管形态各异，但不同园艺类型的生菜共有一些共同的驯化特征，如无叶刺、不开裂的种荚和晚期抽薹。生菜被认为由单一的野生祖先Lactuca serriola驯化而来，随后分化成两种形态不同的主要蔬菜类型：叶用生菜和茎用生菜。尽管全基因组重测序研究揭示了生菜驯化过程中的遗传变异，但表观遗传变异在生菜驯化和分化中的作用在很大程度上仍然未知。

近日，新加坡国立大学申莉莎团队绘制了52个生菜品种的单碱基分辨率DNA甲基化图谱，包括主要的生菜品种和野生近缘种。通过对DNA甲基化图谱、转录组和染色质可及性及互作图谱的多组学综合分析揭示了DNA甲基化变化对基因表达的调控作用，为通过表观遗传工程改善蔬菜提供宝贵的表观基因组资源。相关研究成果以“DNA methylation variations underlie lettuce domestication and divergence”为题发表在《Genome Biology》期刊上。

标题：DNA methylation variations underlie lettuce domestication and divergence（DNA 甲基化变异是生菜驯化和分化的基础）

发表时间：2024-06-17

发表期刊：Genome Biology

影响因子：IF 10.1 / 1区

技术平台：WGBS、RNA-seq、ATAC-seq（易基因优势技术）

为理解生菜驯化和分化的遗传和表观遗传基础，本研究从52个生菜品种中生成了单碱基分辨率的DNA甲基化图谱，包括主要的生菜品种和野生近缘种（wild relatives）。分析结果表明生菜驯化过程中的DNA甲基化显著增加，并揭示了与生菜驯化和分化相关的显著表观遗传变异。特别与叶用生菜和茎用生菜相关的DNA甲基化变异分别与调控和代谢过程相关，而与这两种类型都相关的变异则在应激响应中富集。此外研究还揭示了驯化诱导的DNA甲基化变化可能通过影响染色质可及性和染色质loop来影响附近和远端基因的表达水平。本研究为作物驯化和分化提供了群体表观基因组的见解，并为进一步的驯化、多样性和表观遗传育种提供了宝贵的资源，以促进作物改良。

研究方法

研究使用全基因组亚硫酸盐测序（WGBS）对30日龄的幼苗叶片进行甲基化测序，生成不同品种的600Gb全基因组测序（WGS）数据以用于基因组变异calling。还分析了DNA甲基化、转录组和染色质可及性及相互作用图谱，以揭示DNA甲基化变异对基因表达的作用。

结果图形：

（1）生菜的DNA甲基化变异

图1：生菜驯化过程中 CG 甲基化多样性增加。

野生近缘种（L. serriola、L. virosa、L. indica和L. saligna）和栽培生菜（包括cos、奶油生菜、脆叶生菜和茎用生菜）在种植后2周的幼苗形态。
基于所有CG位点的甲基化水平构建的52个生菜品种的邻接加入（neighbor-joining）系统发育树。
基于CG甲基化水平对所有生菜品种进行的主成分分析（PCA）。
野生生菜（L. serriola）和栽培生菜（L. sativa）中CG甲基化和单核苷酸多态性（SNP）变异的多样性。

（2）生菜驯化过程中的全基因组DNA 甲基化增加

图2：生菜驯化过程中CG甲基化水平升高。

与野生生菜L. serriola（野生）相比，栽培生菜中CG甲基化水平的增加。
生菜驯化过程中1号染色体（Chr1）上甲基化水平变化热图。
基因（左）和TEs（右）周围平均CG甲基化水平。
DMRs在不同基因组区域的分布，分为基因体、+2 kb flanking区域（TSS上游2 kb）、-2 kb flanking区域（TTS下游2 kb）、TEs和不包括TEs的间隔区域。下方显示了整个基因组中不同基因组区域的平均分布作为参考。

（3）栽培生菜中甲基化变化的保守性和分化性

图3：叶用生菜品种间DNA甲基化变化的高相关性。

相对于野生生菜L. serriola，不同生菜品种间CG甲基化变化校正。

b-c. 相对于野生生菜L. serriola，不同生菜品种中共有和特异性高甲基化（b）和低甲基化（c）差异甲基化区域（DMRs）。

d. 热图显示在叶用生菜中发现的类型特异性高甲基化和低甲基化DMRs的甲基化水平。叶用生菜包括cos、奶油生菜（黄油）和脆叶生菜。灰色块表示在叶用生菜和茎用生菜之间显示出显著差异甲基化水平的DMRs。左侧面板展示了LsAMY1（Lsat_1_v5_gn_6_112060）上的一个高保真叶用特异性高甲基化DMR示例，以及LsIQD31（Lsat_1_v5_gn_3_102080）上的一个高保真叶用特异性低甲基化DMR示例。甲基化谱图上方显示的是LsAMY1和LsIQD31的基因结构，其中蓝色和黄色框分别表示外显子和非翻译区，紫色线表示内含子和其他基因组区域。

e. 与这些高保真叶用特异性DMRs相关联的基因的基因本体（GO）富集分析。

（4）茎用生菜的单独进化

图4：单独变化的茎用生菜中的DNA甲基化。

热图显示了相对于野生生菜L. serriola，茎用生菜的特异性高甲基化和低甲基化差异甲基化区域（DMRs）的甲基化水平。灰色块中的DMRs显示了叶用和茎用生菜之间的显著差异，代表了高保真度的茎特异性DMRs。
野生生菜L. saligna中高保真度茎特异性DMRs的甲基化水平。
在L. saligna和茎用生菜中观察到的高保真度茎特异性DMRs中具有相同SNPs区域的富集。
与高保真度茎特异性DMRs相关的基因的GO富集分析。

（5）驯化诱导的DMR与胁迫响应有关

图5：生菜品种共有的驯化诱导DMRs。

热图显示了生菜品种共有的高甲基化和低甲基化差异甲基化区域（DMRs）的甲基化水平。

b-c. 与共有高甲基化（b）和低甲基化DMRs（c）相关的基因的GO富集分析。图表显示了得分最高的10个生物学过程。

d. 在共有驯化诱导DMRs中富集的DNA motifs（上图）与已发表数据集中3XHMG-BOX1和ERF48的结合位点的motifs相似（下图）。E值（e）表示MEME预计的motifs数量，而Q值（q）表示随机motifs具有与目标motifs最优比对概率。

e. 在ERF48结合motifs 10kb内的共有DMRs密度。灰色线表示随机基因组区域。

f. 在基因10kb内的ERF48结合motifs密度。

（6）驯化诱导的DNA甲基化变异通过顺式或反式作用影响基因表达

图6：驯化诱导的DNA甲基化变化通过顺式或反式作用效应基因表达变化。

Meta图显示基因附近（左图）和远离基因（右图）的生菜品种共有驯化诱导DMRs的染色质可及性。星号表示DMRs的染色质可及性与整个基因组相比的显著差异。
与所有基因相比，茎用生菜与野生生菜L. serriola之间DMR相关近端基因（DPGs）和远端基因（DDGs）的基因表达变化（绝对值）增加。
甲基化变化（Chr1: 59,076,400–59,077,800；上图和下图中的中间箱线图）与近端基因（DPG: Lsat_1_v5_gn_1_50480；下图中的右侧箱线图）和远端基因（DDG: Lsat_1_v5_gn_1_50600；下图中的左侧箱线图）相关示例，它们位于一个染色质loop中，物理距离超过64 kb。中间图显示这些基因的结构，其中蓝色和黄色框分别表示外显子和非翻译区，紫色线表示内含子和其他基因组区域。框上的不同字母表示成对比较中的显著差异。

易小结：

本研究揭示了主要栽培生菜和野生近缘种之间的表观基因组变异，为生菜驯化和分化过程中基因调控的表观遗传进化提供了重要见解。这些已鉴定的表观等位基因是促进未来对生菜驯化和分化的功能基因组研究以及表观遗传育种的宝贵资源，以提高生菜产量和抗逆性，实现可持续农业。

表观遗传学在作物驯化中的作用：这项研究揭示了DNA甲基化在生菜驯化和分化中的重要作用，这是之前未被充分探索的领域。
单碱基分辨率的DNA甲基化图谱：研究提供了52个生菜品种的高分辨率DNA甲基化图谱，为深入理解表观遗传变异提供了基础。
表观遗传变异与基因表达的关联：研究发现DNA甲基化变异可能通过影响染色质结构来调控基因表达，这对于理解作物驯化的分子机制具有重要意义。
为作物改良提供资源：本研究不仅增进了对生菜驯化的理解，还为未来的表观遗传育种和作物改良提供了宝贵的资源。

关于易基因全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）

全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS）可以在全基因组范围内精确的检测所有单个胞嘧啶碱基（C碱基）的甲基化水平，是DNA甲基化研究的金标准。WGBS能为基因组DNA甲基化时空特异性修饰的研究提供重要技术支持，能广泛应用在个体发育、衰老和疾病等生命过程的机制研究中，也是各物种甲基化图谱研究的首选方法。

易基因全基因组甲基化测序技术通过T4-DNA连接酶，在超声波打断基因组DNA片段的两端连接接头序列，连接产物通过重亚硫酸盐处理将未甲基化修饰的胞嘧啶C转变为尿嘧啶U，进而通过接头序列介导的 PCR 技术将尿嘧啶U转变为胸腺嘧啶T。

应用方向：

WGBS广泛用于各种物种，要求全基因组扫描（不错过关键位点）

全基因组甲基化图谱课题
标志物筛选课题
小规模研究课题

技术优势：

应用范围广：适用于所有参考基因组已知物种的甲基化研究；
全基因组覆盖：最大限度地获取完整的全基因组甲基化信息，精确绘制甲基化图谱；
单碱基分辨率：可精确分析每一个C碱基的甲基化状态。

技术类型	起始量	特点	覆盖度
常规WGBS	1μg gDNA	正常BS建库技术	95%
Micro DNA-WGBS	1-10000个细胞/1ng基因组DNA	在常规WGBS技术上进行技术改进，使得起始量大大降低，适合珍稀样本的研究	95%
scWGBS	单细胞/1-10个细胞	克服了组织内部细胞异质性的影响，可以满足单个细胞层面的课题研究	20%
Micro DNA-XRBS	1ng gDNA、单细胞	为Micro DNA-WGBS的简化版本，特别适用于大样本量的珍稀样本DNA甲基化研究	20M CG

易基因提供全面的表观基因组学（DNA甲基化、DNA羟甲基化）和表观转录组学（m6A、m5C、m1A、m7G、ac4C）、染色质结构与功能组学技术方案（ChIP-seq、ATAC-seq），详询易基因：0755-28317900。

参考文献：

Cao S, Sawettalake N, Li P, Fan S, Shen L. DNA methylation variations underlie lettuce domestication and divergence. Genome Biol. 2024 Jun 17;25(1):158. pii: 10.1186/s13059-024-03310-x. doi: 10.1186/s13059-024-03310-x. PubMed PMID: 38886807.

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