易基因：MeRIP-seq揭示METTL3介导m6A修饰增加Hspa1a稳定性以抑制细胞衰老 | 研究速递
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老年骨质疏松症主要由成骨细胞功能衰减引起，进而导致骨量减少和骨重塑过程破坏。目前许多研究表明m6A修饰在骨质疏松症的调控中发挥着重要作用，但大多数研究集中在骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化的作用上，而m6A对成骨细胞的直接调控机制尚不清楚。
兰州大学第二医院骨科夏亚一教授和耿彬教授合作，在老年骨质疏松症患者中揭示了m6A修饰和甲基转移酶样3（METTL3）表达降低。进一步体外实验表明，METTL3抑制了成骨细胞衰老，而成骨细胞功能障碍会影响骨代谢平衡。随后MeRIP-seq和mRNA-seq联合揭示了METTL3调控Hspa1a转录本的稳定性。在METTL3抑制成骨细胞衰老过程中，YTH N6-甲基腺苷RNA结合蛋白2（YTHDF2）延缓了Hspa1a mRNA的衰减。METTL3在小鼠成骨细胞中特异性过表达，进一步证实METTL3可以抑制老年骨质疏松症的进展。相关研究成果以“METTL3-mediated m6A modification increases Hspa1a stability to inhibit osteoblast aging”为题发表在《cell death discovery》期刊上。
标题：METTL3-mediated m6A modification increases Hspa1a stability to inhibit osteoblast aging（METTL3介导的m6A修饰可增加Hspa1a稳定性以抑制成骨细胞衰老）
时间：2024.3.27
期刊：cell death discovery
影响因子：IF 7/ 2区
实验方法：MeRIP-seq、mRNA-seq、Western blot、qRT-PCR、免疫荧光和组织学染色等
研究摘要：
本研究揭示了老年骨质疏松症的进展与m6A修饰和METTL3下调密切相关。METTL3过表达可以抑制成骨细胞的衰老。甲基化RNA免疫沉淀测序（MeRIP-seq）揭示了METTL3通过上调Hspa1a mRNA的稳定性来抑制成骨细胞衰老。此外，结果表明METTL3通过m6A修饰增强Hspa1a mRNA的稳定性来调控成骨细胞衰老。YTH N6-甲基腺苷RNA结合蛋白2（YTHDF2）参与METTL3介导的m6A修饰过程中Hspa1a mRNA的稳定。从机制上讲，METTL3以YTHDF2依赖性方式增加Hspa1a mRNA的稳定性，以抑制成骨细胞衰老。本研究结果证实了METTL3在成骨细胞衰老中的重要作用，并表明METTL3可能是老年骨质疏松症的潜在治疗靶点。
结果图形：
（1）老年骨质疏松症中m6A修饰减少
为了研究与年龄相关的骨质流失与 m6A 修饰之间的关系，进行比色法检测骨组织中的m6A水平。检测结果在老年骨质疏松症患者的骨组织中观察到m6A修饰水平显著降低（图1）。由于m6A修饰主要受甲基转移酶和去甲基化酶调控，因此在骨组织中检测METTL3、METTL14、FTO和YTHDC1的mRNA水平。
图1：老年骨质疏松症患者样本中m6A水平变化以及METTL3等基因和蛋白表达情况。
- 老年骨质疏松症患者的骨样本进行了m6A水平的比色评估。（n=10）
- 老年骨质疏松症患者样本进行METTL3、METTL14、FTO和YTHDC1表达的qRT-PCR分析。（n=10）
- 小鼠骨质疏松症骨组织进行m6A水平的比色评估。（n=6）
- western blot分析样本中的METTL3蛋白水平。（n=6）
- H2O2诱导的MC3T3-E1细胞衰老过程中m6A水平的比色分析（n=3）。
- 通过β-半乳糖苷酶染色鉴定衰老细胞（n=3）。
- 透射电子显微镜分析线粒体形态（n=3）。
- western blot分析样本中METTL3蛋白水平（n=3）。
（2）METTL3 抑制体外成骨细胞衰老
在衰老过程中，骨微环境中的各种细胞类型都会经历衰老，导致骨形成减少和骨的负平衡。为了研究成骨细胞衰老是否归因于m6A修饰减少和METTL3表达降低，建立了MC3T3-E1-shMETTL3，并从C57/BL6小鼠的原代成骨细胞中敲低了METTL3。
图2：成骨细胞衰老与METTL3促进的m6A变化密切相关。
- 对METTL3基因敲除后的MC3T3-E1细胞和原代成骨细胞进行m6A水平的比色评估（n=3）。
- β-半乳糖苷酶染色鉴定衰老细胞（n=3）。
- 使用免疫荧光鉴定METTL3和p21的定位和表达，bar = 20 μm（n = 3）。
- JC-1染色分析线粒体膜电位，bar =10μm（n = 3）。
- Western Blot检测METTL3、p53、CDK4和p21蛋白水平（n = 3）。
（3）成骨细胞功能对体外骨微环境代谢的影响
图3：成骨细胞功能影响骨微环境。
- 免疫荧光实验分析METTL3和p21的表达，bar = 20 μm（n = 3）。
- β-半乳糖苷酶染色鉴定衰老细胞（n=3）。
- 使用JC-1染色来评估线粒体膜电位，bar =10μm（n = 3）。
- β-半乳糖苷酶染色鉴定衰老细胞（n = 3）。
- EdU（5-乙炔基-2'-脱氧尿苷）实验评估细胞增殖，bar =50μm（n = 3）。
（4）MeRIP-seq揭示METTL3调控Hspa1a稳定性
为研究METTL3在调控成骨细胞衰老中的潜在分子机制，研究人员在MC3T3-E1细胞中激活METTL3后，进行了MeRIP-seq（甲基化RNA免疫沉淀测序）和mRNA-seq（mRNA测序）。实验结果表明，在MC3T3-E1细胞中鉴定的m6A位点在 “GGAC”序列中富集（图4a），大部分m6A位点位于编码序列（CDS）和3'非翻译区（3'UTR）。Metagene分析显示m6A位点主要位于终止密码子附近。MeRIP-seq和mRNA-seq分析鉴定出13个共有显著基因。验证了7个显著上调的潜在靶标，qRT-PCR结果显示Nr4a3和Hspa1a上调更为显著（图4b）。在Hspa1a终止密码子附近发现m6A峰的高丰度和特异性，表明Hspa1a可能是成骨细胞衰老的关键调控因子（图4c）。通过SRAMP数据库预测揭示Hspa1a mRNA中的多个高度可靠的m6A修饰位点。在METTL3沉默的MC3T3-E1细胞系和原代成骨细胞中，Hspa1a蛋白表达水平显著下调（图4d）。免疫荧光结果也表明在METTL3沉默后Hspa1a表达下调（图4e）。RIP-qPCR结果证实Hspa1a mRNA能直接与METTL3蛋白结合（图4f）。MeRIP-qPCR验证了在METTL3沉默的细胞系中Hspa1a mRNA的m6A修饰水平显著降低（图4g）。随后进行RNA稳定性实验以分析METTL3介导的m6A修饰对Hspa1a表达调控作用机制。METTL3沉默后，Hspa1a mRNA的衰减速度显著快于对照组（图4h）。这些结果表明METTL3增加了Hspa1a mRNA的稳定性并减少了其衰减。通过以上实验，研究人员揭示了METTL3通过m6A修饰正向调控Hspa1a mRNA稳定性的机制，并揭示METTL3可能通过这一机制抑制成骨细胞衰老。
图4： MeRIP-seq揭示METTL3调控Hspa1a稳定性。
- MeRIP-Seq分析显示，成骨细胞“GGAC”motif在m6A位点富集。
- 对7个显著上调的潜在靶标进行qRT-PCR分析（n=3）。
- Hspa1a终止密码子附近的m6A峰具有高丰度和特异性。
- Western Blot分析METTL3沉默后Hspa1a蛋白水平（n=3）。
- 免疫荧光检测Hspa1a表达，bar=20μm（n=3）。
- RIP-qPCR研究Hspa1a mRNA-METTL3蛋白的直接互作（n=3）。
- MeRIP-qPCR分析Hspa1a m6A修饰（n=3）
- qRT-PCR检测放线菌素D诱导后的mRNA水平以分析降解情况（n=3）。
（5）METTL3介导的m6A修饰以YTHDF2依赖性方式调控Hspa1a mRNA衰变
图5：METTL3介导的m6A修饰以YTHDF2依赖性方式调控Hspa1a mRNA衰变。
- JC-1染色检测线粒体膜电位，bar=10μm（n=3）。
- β-半乳糖苷酶染色鉴定衰老细胞（n=3）。
- 免疫荧光检测Hspa1a和p21表达，bar=20μm（n=3）。
- Western Blot检测METTL3、Hspa1a、YTHDF2和IGF2BP1蛋白水平（n=3）。
- RIP-qPCR实验鉴定与Hspa1a mRNA互作的m6A依赖性蛋白（n=3）。
（6）靶向成骨细胞中的METTL3可抑制老年性骨质疏松症进展
图6：靶向成骨细胞中的METTL3可抑制老年小鼠骨质疏松症。
- 小鼠分组和干预措施示意图（n=6）。
- c. f. 通过组织学实验（HE染色、Von Kossa染色和calcein染色，bar=200 μm）来分析小鼠股骨远端情况（每组n=3）。
d. 对小鼠股骨远端进行定量micro-CT分析（每组n=3），以评估骨密度和骨微结构的变化。
e. 通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清中骨代谢标志物水平（每组n=3）。
g.利用免疫组化分析骨组织中METTL3、Hspa1a、p53和p21水平（每组n=3），以评估在骨质疏松症发展中的作用。
h. METTL3介导的m6A修饰以YTHDF2依赖性方式调控Hspa1a mRNA衰减，且METTL3通过抑制成骨细胞衰老来调控老年骨质疏松症进展的示意图，bar=50 μm。
关于易基因RNA m6A甲基化测序(MeRIP-seq)技术
易基因MeRIP-seq技术利用m6A特异性抗体富集发生m6A修饰的RNA片段（包括mRNA、lncRNA等rRNA去除所有RNA），结合高通量测序，可以对RNA上的m6A修饰进行定位与定量，总RNA起始量可降低至10μg，最低仅需1μg总RNA。广泛应用于组织发育、干细胞自我更新和分化、热休克或DNA损伤应答、癌症发生与发展、药物应答等研究领域；可应用于动物、植物、细胞及组织的m6A检测。
大样本量m6A-QTL性状关联分析，传统MeRIP单个样品价格高，通常难以承担。易基因开发建立MeRIP-seq2技术，显著提成IP平行性，实现不同样本间相对定量，降低检测成本。
易基因提供适用于不同科研需求的MeRIP技术：
- m6A甲基化-常量mRNA 甲基化测序（MeRIP-seq）
- m6A甲基化-常量mRNA +lncRNA甲基化测序（lnc-MeRIP-seq）
- m6A甲基化-微量mRNA +lncRNA甲基化测序（Micro-lnc-MeRIP-seq）
- 高通量m6A甲基化-常量mRNA甲基化测序（MeRIP-seq2）
技术优势：
- 起始量低：样本起始量可降低至10-20μg，最低仅需1μg总RNA；
- 转录组范围内：可以同时检测mRNA和lncRNA；
- 样本要求：可用于动物、植物、细胞及组织的m6A检测；
- 重复性高：IP富集重复性高，最大化降低抗体富集偏差；
- 应用范围广：广泛应用于组织发育、干细胞自我更新和分化、热休克或DNA损伤应答、癌症的发生与发展、药物应答等研究领域。
研究方向：
m6A甲基化目前主要运用在分子机制的理论性研究
- 疾病发生发展：肿瘤、代谢疾病（如肥胖/糖尿病）、神经和精神疾病（如阿尔兹海默症/抑郁症）、炎症…
- 发育和分化：早期胚胎发育、个体/组织/器官生长发育、干细胞分化与命运决定、衰老
- 环境暴露与响应：污染、抗逆、生活方式
关于m6A甲基化研究思路
（1）整体把握m6A甲基化图谱特征：m6A peak数量变化、m6A修饰基因数量变化、单个基因m6A peak数量分析、m6A peak在基因元件上的分布、m6A peak的motif分析、m6A peak修饰基因的功能分析
（2）筛选具体差异m6A peak和基因：差异m6A peak鉴定、非时序数据的分析策略、时序数据的分析策略、差异m6A修饰基因的功能分析、差异m6A修饰基因的PPI分析、候选基因的m6A修饰可视化展示
（3）m6A甲基化组学&转录组学关联分析：Meta genes整体关联、DMG-DEG对应关联、m6A修饰目标基因的筛选策略
（4）进一步验证或后期试验
易基因提供全面的表观基因组学（DNA甲基化、DNA羟甲基化）和表观转录组学（m6A、m5C、m1A、m7G）、染色质结构与功能组学技术方案（ChIP-seq、ATAC-seq），详询易基因：0755-28317900.
参考文献：
Wang Y, Chen Y, Xiao H, Liu Z, Liu X, Feng Z, Sheng X, Peng B, Ren X, Xu L, Teng F, Yi Z, Niu Y, Xiang D, Xia Y, Geng B. METTL3-mediated m6A modification increases Hspa1a stability to inhibit osteoblast aging. Cell Death Discov. 2024 Mar 27;10(1):155. pii: 10.1038/s41420-024-01925-4. doi: 10.1038/s41420-024-01925-4. PubMed PMID: 38538596.
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