易基因：cfDNA甲基化在器官和组织损伤检测中的强大力量
大家好，这里是专注表观组学十余年，领跑多组学科研服务的易基因。
检测器官和组织损伤对于早期诊断、治疗决策和监测疾病进展至关重要。由于DNA甲基化模式可以响应组织损伤而改变，甲基化检测提供了一种有前途的方法，在早筛早诊、疾病进展监测、治疗效果和器官移植评估等可行性方面具有潜在应用。组织或器官损伤后释放到血流中的cfDNA（cell-free DNA）可以作为损伤的生物标志物。cfDNA的表观遗传状态（包括DNA甲基化模式）可以提供对组织和器官损伤程度的见解。本文强调DNA甲基化作为一种广泛研究的表观遗传修饰，在细胞生长、分化和疾病发展等过程中起着关键作用。介绍了多种高度精确的5-mC甲基化检测技术，这些技术是获得与组织损伤相关表观遗传改变的深刻见解的有力工具。深入研究了器官和组织损伤中DNA甲基化变化的潜在机制，包括炎症、氧化应激和DNA损伤修复机制。介绍了cfDNA甲基化在检测特定器官组织和器官损伤中的研究现状。最后概述了在临床试验中鉴定与组织和器官损伤相关的特定甲基化标记中的多个步骤。本综述将探讨基于cfDNA甲基化的检测器官和组织损伤的机制和研究现状，潜在机制以及在临床实践中的潜在应用。
Introduction
检测器官和组织损伤对于及时诊断和有效治疗各种疾病和病症至关重要。早期发现组织损伤可以及时干预，防止进一步的损伤并可能改善预后。监测疾病进展也可以帮助告知治疗决策，并根据需要进行调整。此外，评估治疗效果可以帮助确定干预措施是否有效，并为继续或修改治疗计划的决定提供信息。最后，在移植医学中，检测组织损伤对于评估移植器官的生存能力和确保受体成功结果至关重要。在此前研究中，组织切片的组织病理学检查通常被认为是检测组织和器官损伤的“金标准”。然而，这种方法是高度侵入性的，不适用于组织和器官损伤的早期筛查。
CpG位点是DNA上的特定区域，以C（胞嘧啶）和鸟嘌呤核苷酸命名，通过磷酸二酯键连接。这些位点广泛分布于整个人类基因组中，对基因表达和基因组稳定性至关重要。在许多研究中，CpG位点甲基化状态与人类疾病的发生和发展密切相关。DNA甲基化也因组织损伤而变化。基于甲基化的检测为检测器官和组织损伤提供了一种有前途的方法。基于DNA甲基化模式的表观遗传分析包括DNA甲基化模式的研究，以检测可能反映组织损伤或疾病相关变化的迹象。这些测试方法具有高度的特异性和灵敏度，可应用于各种样本类型，包括血液、尿液和组织活检，促进非侵入性数据收集，并大大推进组织损伤的早期诊断。基于甲基化的检测方法正在研究一系列应用，从早期发现和监测疾病进展到评估治疗效果和评估移植器官活力。
液体活检，特别是血浆中循环cfDNA甲基化分析，可能成为组织损伤检测中一种有前途的非侵入性诊断方法。血液或体液样本的收集是一种非侵入性程序，不需要组织切除或组织活检，从而避免了传统组织检查的痛苦和风险。大多数cfDNA片段的范围为80-200 bp，长度对应于核小体大小160-180 bp。起源组织解卷积是cfDNA甲基化分析中的关键技术，使研究人员能够根据DNA甲基化模式确定cfDNA来源。该技术基于一个核心概念：不同的组织和器官在其DNA甲基化谱中具有独特的表观遗传特征。因此，当这些组织或器官受损时，例如由于癌症、创伤或其他导致细胞死亡的疾病，它们会将cfDNA释放到血液中（图1A）。研究人员可以分析这些cfDNA样本中的DNA甲基化模式，并尝试将其与已知组织特异性DNA甲基化模式的参考数据库进行比较。通过这种比较，他们可以解卷积或确定给定cfDNA样品来源组织或器官。这项技术的优点是能够以非侵入性方式检测和监测组织特异性损伤，而不需要传统的组织活检。
图1：cfDNA的来源。
- cfDNA向体液中的释放来源于组织和器官，包括血液、脑脊液和尿液等。
- 受损的组织和器官将甲基化模式改变的cfDNA释放到血液中，可以检测到
如图1B所示，组织和器官损伤后cfDNA形式的表观遗传标记物释放到血流中，使cfDNA成为评估组织和器官损伤的有价值的生物标志物。此外，cfDNA的表观遗传状态，包括DNA高甲基化和低甲基化模式，可以提供对组织和器官损伤程度的见解。总体而言，cfDNA的DNA甲基化状态可用作组织和器官损伤的生物标志物。本文将研究cfDNA甲基化涉及的潜在机制，用于检测器官和组织损伤的cfDNA甲基化模式的当前研究现状，以及这些检测在临床实践中的潜在应用。
表观遗传学和DNA甲基化
即使DNA序列保持不变，真核基因表达也通过多种机制受复杂调控，这种现象被称为表观遗传学。表观遗传调控涉及多种机制，包括DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA等。其中DNA甲基化研究非常广泛。
在真核生物中，DNA甲基化涉及在DNA甲基转移酶的催化下，在DNA中C的第5个碳上添加一个甲基，产生了5-mC（5-甲基胞嘧啶），主要位于CpG位点。人类基因组中约有2.8M的CpG位点，但其分布并不均匀。CpG序列平均仅发生约1%，CGI（CpG岛）是密集的区域，其频率是平均频率的五倍以上，通常定义为超过200个碱基对长的基因组区域，GC含量超过50%，CpG比率超过60%。超过60%的基因，包括具有组织特异性表达模式的基因，在其启动子区域和第一外显子中具有CpG岛。
在正常组织基因组中，约70%的CpG位点被甲基化，而大多数CpG岛未甲基化。一些CGI基因被甲基化，如非活性X染色体上的基因和印迹基因。甲基化在各种生物过程中起着至关重要的作用，包括细胞生长、分化、X染色体失活、基因组印迹、基因沉默、防御外源基因以及多细胞生物中的异生素代谢。
表观遗传机制的研究在科学研究和医学中具有巨大意义，增强了对基因调控、疾病发生和遗传以及创新疗法发展的理解。
DNA甲基化在器官和组织损伤中的变化机制
DNA甲基转移酶（DNMTs）是一类在细胞中起关键作用的酶，可以调控DNA甲基化。DNMT主要负责向DNA中的胞嘧啶残基添加甲基，形成5-甲基胞嘧啶，从而实现DNA甲基化。DNMT能够与DNA结合并识别靶DNA序列，通常是CpG。一旦DNMT与靶DNA序列结合，它们就会将甲基从SAM供体转移到DNA中的胞嘧啶碱基。该过程涉及形成共价键，将甲基添加到胞嘧啶碱基的第五个碳原子上，产生5-mC。DNMT1（DNA甲基转移酶-1）作为维持DNMT，主要任务是在DNA复制和细胞分裂过程中维持DNA甲基化稳定性。DNMT1可以识别新合成的未甲基化DNA链，并在DNA复制过程中添加甲基，以确保每一代细胞中DNA甲基化模式的正确遗传。DNMT3A和DNMT3B是de novo的DNMT，负责在细胞分化和发育过程中引入新的DNA甲基化。这些酶可以将甲基引入特定基因或基因组区域，从而调控基因表达并影响细胞功能。
DNA去甲基化：除DNMT外，DNA去甲基化酶（如TET（10-11易位））也是DNA甲基化动态平衡的关键组成部分。TET酶可以从DNA中去除甲基，将5-mC转化为5hmC（5-羟甲基胞嘧啶），并参与DNA去甲基化过程。AID（activation-induced cytidine deaminase，活化诱导的胞嘧啶脱氨酶）和AB（Apobec）是脱氨酶，通常与DNA碱基脱氨和脱氧核糖修饰有关，而不是直接参与DNA甲基化或去甲基化反应。它们在改变DNA碱基方面起作用，例如将胞嘧啶转化为尿嘧啶，而不涉及DNA甲基的添加或去除。TDG（胸腺嘧啶DNA糖基化酶）和SMUG1（单链选择性单功能尿嘧啶DNA糖基化酶1）是与DNA修复相关的两种酶，在维持DNA碱基的完整性和纠正DNA碱基错误方面起着至关重要的作用。这些酶向DNA分子引入脱氨或脱氧核糖基化等变化，影响DNA甲基化状态。组织和器官损伤可以通过各种机制调控DNMT和DNA去甲基化酶，从而影响DNA甲基化状态，包括炎症、氧化应激和DNA损伤修复机制。这些机制可以相互作用，引起DNA甲基化模式的复杂变化，并导致损伤和疾病的持续（图2）。
图2：器官和组织损伤中的DNA甲基化和去甲基化机制。组织和器官损伤可以通过各种机制调控DNMT和DNA去甲基化酶（如TET和TDG），从而影响DNA甲基化状态，包括炎症、氧化应激和DNA损伤修复机制
炎症
在组织和器官损伤后，身体启动炎症反应以清除受损的细胞和组织，促进修复和再生。然而，这种炎症反应也可能导致DNA甲基化变化，因为炎症反应可以产生活性氧（ROS），亚硝酸盐和其他可能直接或间接影响DNA甲基化的有害物质。炎症还可以激活免疫细胞，导致细胞因子和其他信号分子的分泌，从而改变DNA甲基化模式。例如，IL-6（细胞因子白细胞介素-6）和STAT3（信号转导和转录激活因子3）已被证明可增加DNMT活性，从而导致某些基因的DNA甲基化增加。过量的IL-15（细胞因子白细胞介素-15）在动物模型中诱导DNMT3b（DNA甲基转移酶-3b）上调和整体DNA高甲基化。
氧化应激
由于受损细胞释放的自由基、过氧化物和其他氧化剂，组织和器官损伤可能会增加细胞氧化应激，可能会破坏DNA并改变调控DNA甲基化的酶活性。例如，氧化应激可导致DNMT氧化，导致活性改变和DNA甲基化模式改变。在最近对Graves病患者外周血单核细胞的研究中，发现活性氧增加导致DNMT1表达增加，反过来又与促进Graves病自身免疫的免疫调控基因异常甲基化模式有关。类似地，在多柔比星诱导的心脏毒性的研究中，多柔比星诱导心脏细胞损伤和氧化应激，其产生自由基和一氧化氮以响应应激。氧化应激增加并下调DNMT1酶活性，导致DNA甲基化的线粒体功能障碍。氧化应激还可以改变从DNA中去除甲基的酶（如TET酶）活性，从而导致DNA甲基化模式变化。在多囊卵巢综合征疾病研究中构建的细胞损伤模型中，发现细胞损伤降低了TET水平并导致细胞甲基化水平升高。
DNA损伤修复
DNA损伤是组织和器官损伤的常见后果，DNA修复机制被激活以修复损伤。DNA修复过程可以影响DNA甲基化模式，因为一些DNA修复酶可以改变DNA甲基化水平。例如，PARP1酶（聚（ADP-核糖）聚合酶-1）是一种参与DNA修复、染色质重塑和基因表达的核酶（nuclear enzyme），可以催化甲基全基因组染色质去除。PARP1与染色质全基因组的结合与DNA甲基化模式互斥，表明PARP1与DNA甲基化之间存在功能互作。事实上，抑制PARylation会导致DNA甲基化模式的全基因组变化。DNA双加氧酶AlkB也可以调控DNA甲基化水平，AlkB可以通过在Fe（II）离子，α-KG和氧气存在下的氧化去甲基化机制将m3C和m1A直接转化为未甲基化碱基。在一项血液疾病研究中，生发中心的B细胞在DNMT1帮助下分化，改变其DNA模式以正确分化。DNMT1在DNA甲基化和双链断裂修复中发挥双重作用。
总之，组织和器官损伤可以通过多种机制引起DNA甲基化模式变化，这些机制可以互作以产生DNA甲基化模式的复杂变化。
5-mC甲基化检测技术
研究人员利用各种DNA甲基化检测方法研究cfDNA中的甲基化，从而了解健康和疾病状态下的甲基化变化。这些方法主要包括一系列5-mC甲基化检测，可分为以下几类：
非测序的甲基化检测方法
非测序甲基化检测方法通常不涉及DNA测序，而是依赖各种化学或生物技术来分析DNA甲基化状态。这些方法包括限制性酶消化，包括使用甲基化敏感酶在特定核苷酸序列切割DNA，从而可以研究DNA甲基化。例如，von Kanel等人结合限制性内切酶消化和实时PCR或Xianfeng Wang等人基于CRISPR/Cas13a的策略等方法能够精确评估单个位点的甲基化状态和拷贝数变化。此外，MSP（甲基化特异性PCR）和其他使用亚硫酸盐处理的DNA模板的基于PCR的方法是分析特定位点DNA甲基化的灵敏和特异性技术，MSP使用甲基化特异性引物选择性扩增甲基化或未甲基化的DNA序列。这些方法，包括TaqMan实时FQ-MSP（TaqMan实时甲基化特异性PCR）和ddPCR（数字液滴PCR），提供了高精度和灵敏度，使其成为研究DNA甲基化的有价值的工具。例如，MSP联合ddPCR已被用于检测原发性硬化性胆管炎患者的胆管癌标志物。此外，HRM（高分辨率熔解）是一种基于甲基化和非甲基化DNA片段的不同熔解行为检测DNA甲基化的方法。HRM允许对DNA甲基化进行定性和定量分析，而不需要昂贵的测序技术，从而提供了一种广泛用于DNA甲基化研究的快速，高通量和经济高效的方法。Wojdacz和Dobrovic的MS-HRM（甲基化灵敏的高分辨率熔解）方案可以检测未甲基化中的甲基化panel，其灵敏度与MSP相当。Lasse Kristensen等人还开发了一种无探针定量MSP分析方法，使用HRM分析进行可靠检测，即使在0.1%甲基化标准下也是如此。此外，甲基化芯片如Illumina的HM450K（Illumina Infinium HumanMethylation450 BeadChip）和850K（Illumina Infinium methylation EPIC Bead Chip）为全面的甲基化分析提供了具有成本效益和高通量的平台，HM450K靶向人类基因组中超过485000个胞嘧啶位点，并被广泛用于癌症研究。较新的850K芯片扩展了覆盖范围，包括针对调控区的其他探针，但这些阵列的全基因组覆盖范围有限，可能无法捕获所有甲基化信息。现已更新至935k芯片。
测序的甲基化检测方法
基于测序的DNA甲基化检测方法包括一系列用于研究DNA甲基化模式的技术。一种广泛使用的方法是BSP（亚硫酸盐测序PCR），它将PCR扩增与Sanger测序相结合，以鉴定单个CpG位点的甲基化位点。BSP有两种形式：直接BSP，它直接对PCR产物进行测序，克隆BSP，它涉及将PCR产物克隆到载体中进行测序。然而BSP具有局限性，例如对低水平镶嵌的灵敏度和潜在的PCR诱导的偏倚。
焦磷酸测序通过定量检测核苷酸的掺入来实时高分辨率和灵敏地监测DNA甲基化，这对于各种研究和临床应用都很有价值，包括癌症预测和重复元素研究。
WGBS（全基因组重亚硫酸盐测序）提供了全面和高分辨率的全基因组甲基化信息，是甲基化检测的“金标准”，但它面临着复杂的数据处理和高测序要求等挑战。另一方面，MCTA-seq（甲基化CpG串联扩增和测序）是一种灵敏的方法，能够分析微小的基因组DNA量（低至7.5 pg），有望用于非侵袭性癌症筛查。然而，与全基因组方法相比，它可能需要专门的设备，且覆盖范围有限。
靶向亚硫酸盐测序（Target-seq）选择性地扩增特定的基因组区域，将甲基化阵列的成本效益与亚硫酸盐测序的数字信号相结合。可以针对特定的基因或区域进行定制，但可能需要额外的时间和资源来进行探针设计和合成。
RRBS（减少代表性亚硫酸盐测序）是一种经济有效的方法，专注于CpG富集区域，并实现了scRRBS（单细胞RRBS）等进步，为肿瘤负荷估计和疾病生物标志物发现提供了见识。易基因研发cfDNA-RBS技术，特异性捕获CCGG位点两端的DNA，通过亚硫酸盐测序，实现高深度，单碱基分辨检测CG位点甲基化信息。DNA起始量仅需1ng，是目前肿瘤甲基化标志物检测研究的优选技术。
MeDIP-Seq（甲基化DNA免疫沉淀测序）减少了甲基化测序所需的DNA input，使其适用于cfDNA甲基化检测。该方法的扩展cfMeDIP-seq（cfDNA甲基化DNA免疫沉淀和高通量测序）可应用于DNA可用性有限的各种样品类型，可能将其应用扩展到癌症检测之外。
MBD-Seq（CpG甲基化结合结构域富集测序）使用MBD（甲基CpG结合结构域）蛋白选择性捕获甲基化DNA片段，有效鉴定和定量甲基化区域，特别是CpG和CGI富集区域。超低 input cfDNA甲基化分析方法cfMBD-seq（cfDNA-MBD-seq）优化了用于各种样品类型的MBD捕获条件。
纳米孔测序是一种革命性的技术，可直接检测DNA分子通过纳米孔时的电流变化，从而实现直接甲基化检测，而无需化学修饰。例如ONT（牛津纳米孔技术）具有高通量、高分辨率和单分子测序等优点，在包括癌症检测在内的各种研究和临床应用中具有重要价值。然而它有局限性，包括单核苷酸变异和插入/缺失的每碱基成本和错误率较高。
基于SMRT（单分子实时）技术的PacBio测序产生异常长的DNA读长，使其适用于研究复杂的基因组，结构变异，重复序列和重复元件的表观遗传变化。可以在没有GC或AT含量偏好的情况下分析不同的基因组和DNA样品。
cfDNA甲基化检测特异性组织及器官损伤的研究现状
基于cfDNA甲基化的检测在检测组织和器官损伤方面具有巨大潜力，该领域的进一步研究可以为各种组织和器官疾病提供新的诊断和预后工具。以下描述了cfDNA甲基化在检测特定器官组织和器官损伤中的研究现状（表1）。
表1：特定组织和器官损伤的cfDNA甲基化标记
肝脏
基于肝源性cfDNA甲基化检测方法已被用于检测各种情况下的肝损伤，包括乙型肝炎和丙型肝炎感染、非酒精性脂肪肝、肝细胞癌和肝移植。Miguel Waterhouse等人使用数字液滴PCR检测cfDNA中PTK28基因特异性甲基化标记，以检测急性移植物抗宿主病患者的肝组织损伤。区分肝脏中aGvHD（急性移植物抗宿主病）和非aGvHD（非急性移植物抗宿主病）的阈值为1.5（灵敏度=0.928；特异性=0.910），肝损伤aGvHD的临床改善导致甲基化PTK2B浓度降低。在另一项关于癌症对宿主组织损害的研究中，发现受癌症影响的器官中细胞死亡可以通过cfDNA组织特异性甲基化模式来检测。在肝细胞癌研究中，通过Illumina Infinium 450k芯片鉴定了三种肝组织甲基化特异性标志物（cg02396797/ cg030646442/cg21178851）。与健康供体、局部癌症患者或非肝转移性疾病患者相比，肝转移患者表现出更高水平的肝细胞来源cfDNA，无论是通过肝细胞来源cfDNA比例或每毫升肝细胞基因组当量来检测。使用561（基因组当量/mL）的肝源性特异性cfDNA标记物，检测肝转移和肝损伤的特异性和灵敏度分别为95%和35%。此外，肝细胞cfDNA水平能够区分有无肝转移的4期癌症患者（AUC=0.81，95%置信区间0.73-0.89，P<0.0001）。另一项研究描述了一种通过基于携带肝细胞特异性甲基化模式的cfDNA片段的定量鉴定肝细胞中特异性非甲基化的三个基因组位点（ITIH4，IGF2R和VTN）来检测急性肝细胞死亡的方法。通过ddPCR分析了来自健康个体、肝移植患者、肝脏供体、败血症患者和杜兴氏肌营养不良症的血液样本，结果表明，这三种肝细胞来源的cfDNA分析可以提供有关肝细胞死亡的特定和敏感信息。它提供了肝损伤的近实时指示，并可以动态监测肝损伤。
肾脏
基于甲基化的检测方法已越来越多地用于检测肾脏损伤并了解与肾脏疾病相关的潜在分子机制。在肾脏患者中观察到特定基因启动子区域的高甲基化。在人类急性肾损伤的研究中，通过焦磷酸测序评估了健康对照组和急性肾损伤患者尿液和全血中cfDNA的KLK1基因启动子区四个位点的甲基化状态。结果表明，AKI患者血液和尿液中甲基化的KLK1基因启动子在全基因组模式中高于健康对照组（P<0.0001），表明KLK1基因甲基化有可能成为监测肾损伤的标志物。在另一项研究中，手术后第二天，通过定量甲基化特异性聚合酶链反应检测到13名死者和10名活体肾移植受者以及65名健康对照者尿液DNA中两个基因启动子（DAPK和CALCA）的异常甲基化，移植受者尿液中发现CALCA基因启动子异常甲基化的可能性明显高于健康对照组（100%比31%；P<0.0001）。与活体供体移植相比，死亡患者尿液中钙质高甲基化增加（21.60） ± 12.5比12.19 ± 4.7条；P = 0.04）。此外，与急性排斥反应和缓慢或快速移植功能相比，活检证实的急性肾小管坏死患者的尿钙异常高甲基化增加（平均值：20.40±6.9、13.87±6.49、17.17±13.4；P=0.67）（16.9±6.2和18.5±13.7；P=0.5）。这些结果表明，尿DAPK和CALCA基因表观遗传学是一种有前途的急性缺血性损伤生物标志物肾移植方法。在一项针对肾移植患者的研究中，分析了尿液cfDNA，以了解感染与肾组织损伤之间的关系。结果显示，移植后组织特异性cfDNA尿液绝对浓度由于应激损伤而增加，但在没有感染的10天后恢复到基线。肾病合并BK病毒感染患者的肾源性cfDNA水平显著高于正常人和单纯BK病毒感染患者（P=4×10-4，P=7.9×10-3）。此外，细菌感染患者的膀胱和白细胞cfDNA水平升高（AUC=0.91），表明感染与组织损伤之间可能存在相关性。cfDNA片段大小谱可以提供一个指标，通过该指标可以对具有不同感染症状的患者进行分层。这些发现表明，分析cfDNA水平可以提高我们对感染相关肾损伤的理解，并可能导致更好的诊断工具和治疗方法。
心脏
基于cfDNA甲基化的检测已被用于检测各种情况下的心脏损伤，包括心脏直视手术和MI（心肌梗塞）。一项新的研究评估了cfDNA分子的六个非甲基化位点作为心脏直视手术后心脏损伤的标志物。使用六种心肌细胞特异性DNA非甲基化标记物检测42名接受心脏直视手术的婴儿血浆中的心脏cfDNA。手术后心脏cfDNA升高，反映了与手术直接相关的组织损伤，大多数患者术后cfDNA降低。本研究还使用心脏cfDNA水平来预测手术结果，选择机械通气持续时间（大于或小于24小时）和最大VIS（大于或小于20小时），并使用ROC（接受者操作特征）曲线作为临床结果。作为机械通气持续时间或最大VIS的预测指标，术后6小时心脏cfDNA的AUC分别为0.7475和0.7555。类似地，在另一项研究中鉴定出心肌细胞甲基化标记物（FAM101A）。ddPCR用于检测完全未甲基化的FAM101A的血浆cfDNA浓度，其可以灵敏且特异性地检测心肌细胞损伤。脓毒症患者的临床观察表明，心脏cfDNA水平不受肾脏或肝脏损伤的显着影响。Jie Ren等人发现，当心肌损伤发生时，cfDNA被释放并鉴定出位于CORO6、CACNA1C（两个位点）、OBSCN、CRIP1和ZNF503-AS2的CGI中的六个CGCGCGG位点，显示出心脏特异性高甲基化模式。在这些标记物中，CORO6在心脏中显示出最特异性甲基化模式。继续研究针对该特定位点的ddPCR测定法的开发，该测定法有效地检测了MI患者入院时cfDNA中心脏损伤的信号。
肺
基于肺器官特异性cfDNA甲基化检测已被用于检测各种情况下的肺损伤，包括慢性阻塞性肺病、肺癌、肺结节和支气管检查后。在2022年的研究中鉴定了17个具有肺特异性甲基化模式位点的甲基化状态，并将其用于评估健康志愿者和肺部疾病患者血浆中肺源性cfDNA。结果表明，正常肺上皮的cfDNA甲基化标记允许对肺源性cfDNA进行突变独立、灵敏和特异性检测，从而报告正在进行的肺损伤。Wenhua Liang等人开发了一种新的非侵入性诊断方法，该方法基于肺损伤释放的cfDNA甲基化分析中的9种标志物来检测早期肺癌并将肺癌与良性肺结节区分开，该模型特异性达到93.2%。这九个标记是cg19864007\U cg22636429\U cg15542994、cg26970841\U cg03978375\U CG2482667、cg04175417、cg21962423、cg23156742、cg06287318、cg21963643、cg07568344和cg12545252。
脑
在2022年探索侧支组织损伤的液体活检研究中，还鉴定了10个基因组位点，这些位点在神经元（cg13131859/cg10030512/cg12560421/cg18519737）、少突胶质细胞（cg26765599/cg20637405/cg25396488）或星形胶质细胞（cg22031783/cg01623475/cg01623475）中未甲基化。来自每种脑细胞类型的信号产生ROC曲线，每种脑细胞类型的标志物都能够识别脑转移患者的血浆，AUC为0.72-0.81，神经元标志物的95%特异性、灵敏度为17.2%，星形胶质细胞标志物的95%特异性、灵敏度为13.8%。
胰腺
甲基化组织研究已经能够在器官中定位特定细胞类型，并且可以通过cfDNA甲基化分析检测细胞损伤。例如，在血浆胰腺β细胞特异性cfDNA的研究中，发现70%的β细胞中有六种特异性生物标志物（Fbxl19、Mtg1、Leng8、Zc3h3、INS、INS反义）完全未甲基化，其余30%表现出一个或两个CpG位点甲基化。该研究发现胰岛移植后胰岛β细胞中cfDNA甲基化标志物显著升高，反映了β细胞的损伤和死亡。此外，鉴于β细胞中未甲基化INS-CpG位点频率增加，细胞死亡后释放到循环中的未甲基化与甲基化INS-DNA比例反映了β细胞死亡。一项研究在编码PRMT1染色质靶标（CHTOP）的基因内鉴定了一个基因内CpG位点，该位点对INS具有互补的组织特异性，可用于增加糖尿病前期和糖尿病青年检测胰岛损伤的信心。两种未甲基化生物标志物组合的特异性高达100%。
肌肉
肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种进行性神经退行性疾病，可导致上运动神经元和下运动神经元死亡。目前，尚无确定的ALS循环生物标志物。因此，很难监测疾病进展并有效评估治疗反应。cfDNA提供了一个检测ALS细胞死亡的机会，填补这些空白。在一项研究中，从20名ALS患者和20名对照中分离出血浆cfDNA，与对照组相比，cfDNA用于鉴定ALS患者RHBDF2基因中的新型差异甲基化标记。该研究进行了ROC分析，以确定RHBDF2基因ALS的诊断效果。其中，RHBDF2基因具有两个增强子区域，即CpG1和CpG2。CpG1的AUC为0.724（CI 0.559-0.888；P=0.017），CpG2的AUC为0.695（CI 0.527-0.863；P=0.038）。区分ALS患者和对照组的最佳阈值为CpG1的65.97%（灵敏度=0.850，特异性=0.526）和CpG2的83.26%（灵敏度=0.800，特异性=0.474）。在现有研究中，针对甲基化cfDNA开发了一种高校的EM（期望最大化）算法CelFiE（通过期望最大化进行cfDNA分析），其中CelFiE的input是WGBS参考数据，允许低覆盖率和噪声数据。在该研究中，使用CelFiE从ALS患者和年龄匹配的对照中检测到cfDNA。ALS和对照中cfDNA的总体丰度显示出显著差异。ALS组（n=28，平均值=297.2±110.57 pg/ul）和对照组（n=25，平均值=218.78±139.17 pg/ul）。肌萎缩侧索硬化组（ALS组）骨骼肌比例估计值与对照组相比有显著性差异（P=5.02×10-2）。总之，这些结果表明cfDNA是鉴定肌肉萎缩和死亡的第一个定量生物标志物的有希望的方向，这是ALS的标志。
总的来说，人们对使用基于甲基化检测方法来检测器官和组织损伤的迹象越来越感兴趣，并且在各种情况下发现了许多有希望的标记物（图3）。然而，需要进一步的研究来验证这些组织特异性甲基化标记，并开发有效的临床诊断和预后工具。
图3：在先前的研究中，已经在组织和器官损伤中发现了cfDNA甲基化的生物标志物。这些生物标志物10个与大脑有关，9个与肺有关，6个与心脏有关，7个与肝脏有关，3个与肾脏有关，7个与胰腺有关，1个与肌肉有关
从组织器官损伤特异性cfDNA甲基化标志物鉴定到临床检测路径
基于甲基化的损伤检测依赖于组织和器官损伤后DNA甲基化模式变化。甲基化模式对于每种细胞类型都是特异性的，在同一个体内部和同一细胞类型中保守，并且在生理或病理条件下高度稳定。因此有可能利用与组织和器官损伤相关的特定cfDNA甲基化模式来鉴定起源组织并推断组织和器官损伤的程度。鉴定与组织和器官损伤相关的特定甲基化标记及其在临床检测中的应用需要多步骤方法。然而，鉴于新生物标志物的不断发现和提出，建立一个强大的生物标志物验证和认证系统以确保广泛接受和正确使用成为当务之急。遵循生物标志物认证的各种原则，推断鉴定与组织和器官损伤相关的特定甲基化标志物并将其应用于临床检测过程可能需要几个不同的阶段，如图4所示。值得注意的是，利用甲基化分析进行组织损伤检测仍处于早期研究阶段。到目前为止，还没有进行临床研究，也没有将商业产品引入临床环境。
图4：cfDNA甲基化检测组织器官损伤的发展路径。该路径概述了将潜在标志物转化为诊断和监测组织和器官损伤的临床有用工具所必需的研究和开发进展
鉴定和验证潜在的甲基化标记
美国食品药品监督管理局（FDA）对生物标志物的使用设定了四个类别：预后性、预测性、反应指示性和疗效反应性（表2）。首先，通过进行文献综述，并确定与组织和器官损伤相关的潜在甲基化标志物。这可以通过响应损伤的甲基化变化的研究或者已经鉴定与健康组织相比患病组织中的DMR（差异甲基化区域）的研究来完成。例如在肝损伤生物标志物的研究中，通过检查WGBS数据并鉴定差异甲基化或差异非甲基化区域来选择肝细胞特异性CpG位点。为了选择高甲基化标记，确定了肝细胞样品的75th百分位数和所有非肝细胞样本的5th百分位数之间差异超过0.5的区域。对于低甲基化标记物，需要在95th和20th百分位数之间有0.5的差异。通过这种方式，总共筛选出三种肝细胞标志物（cg02396797、cg030646442、cg21178851）。甲基化DNA数据库是研究与组织损伤相关的DNA甲基化模式的宝贵资源。这些数据库可用于鉴定生物标志物、理解分子机制、评估严重程度、监测治疗反应以及研究环境和生活方式因素。数据库包括参考序列数据库、癌症相关数据库和疾病相关数据库（表3）。这些数据库为有兴趣鉴定与组织和器官损伤相关的甲基化标记的研究人员提供了宝贵的资源。
表2：FDA生物标志物分类
表3：常见DNA甲基化数据库的内容和网站
建立检测分析
一旦确定了潜在的甲基化标记，就需要开发一种甲基化检测方法，可以准确检测这些标记中的甲基化变化。根据所分析的特定标记，检测方法可以基于不同的技术，例如MSP（甲基化特异性PCR）、焦磷酸测序（pyrosequencing）、WGBS（全基因组甲基化测序）或DNA甲基化芯片。设计分析方法后，需要优化检测参数，包括优化引物设计、退火温度（annealing temperature）、循环条件和检测方法等检测参数，以确保准确可靠地检测已鉴定标记中的甲基化变化。
例如Miguel Waterhouse开发了基于PTK1B和SESN3基因甲基化的ddPCR甲基化测定法，以分析急性移植物抗宿主病患者的组织损伤。同样Tulsi K.Mehta等人设计了特异性扩增CALCA基因的引物和探针，以开发一种qPCR（定量PCR）检测方法，该方法有望用于评估移植环境中的急性肾损伤。在人类急性肾损伤的研究中，通过焦磷酸测序评估了KLK1基因的四个连续CpG甲基化，位于转录起始位点上游-203bp至-135bp之间。在cfDNA甲基化研究中，Roni-Lehmann-Werman等人建立了ddPCR程序来检测cfDNA中ITIH4、IGF2R和VTN的甲基化状态，其中甲基化敏感的TaqMan探针用于分析亚硫酸氢盐处理的cfDNA。探针的有限长度（最多30 bp）决定了它们只能覆盖2-4个提供信息的CpG位点。IGF2R位点覆盖了四个CpG。VTN位点的探针中只覆盖两个CpGs ，预测非肝组织DNA中相对较高的噪声频率（阳性液滴）。设计了两个TaqMan探针以提高特异性，每个探针都从VTN位点相同扩增的100 bp片段中鉴定出不同嘧啶簇（每个簇包含两个CpG位点）中的甲基化缺失，并且每个探针都用不同的荧光团标记。
分析有效性
分析有效性是验证检测方法的一个重要方面，该检测方法评估所开发测定的准确性和可靠性，包括精确度、灵敏度和特异性。为了确保所开发的甲基化检测方法的分析有效性，应采取以下步骤：
精确度评估：使用已知甲基化状态的对照样品，评估检测方法的精确度。通过分析重复样品来计算内部精确度和外部精确度，以确定方法的精确度。
灵敏度评估：使用已知甲基化水平较低或甲基化变化较小的样品，评估检测方法的灵敏度。评估该方法准确检测微小甲基化变化的能力。
特异性评估：使用具有不同甲基化模式或来自不同来源的样品，评估检测方法的特异性。确定该方法准确检测甲基化变化而无假阳性的能力。
使用具有已知甲基化状态的对照样品验证开发的测定法有助于建立检测方法的准确性和灵敏度。这有助于评估该方法在甲基化检测中的性能，并为其临床应用提供可靠的基础。
临床有效性
在建立分析有效性后，会启动临床研究以建立临床有效性：证明生物标志物和检测方法适合特定使用背景的目的，即分析结果将为医疗决策提供信息。应使用临床样品评估所开发检测方法的临床有效性，例如从具有特定组织或器官损伤的患者获得的血液或组织样品。该验证过程旨在确定该测定是否可以有效区分有损伤和无损伤患者，并评估损伤个体的临床灵敏度、临床特异性和检出率。临床灵敏度是指测定正确鉴定具有特定组织或器官损伤的个体的能力，而临床特异性是指测定正确识别没有损伤的个体的能力。应评估该测定的灵敏度和特异性，以确定其在临床环境中的准确性。此外，应评估受伤个体的检出率，这反映了临床诊断为受伤的患者中阳性结果的比例。这些信息可以帮助评估检测方法在检测预期患者群体中特定组织或器官损伤方面的性能。
例如，基于PTK1B基因的ddPCR甲基化检测方法在28名急性移植物抗宿主病（aGvHD）患者和11名无相关症状的患者中进行了临床验证，区分肝脏aGvHD与非aGvHD的最佳阈值为1.5（logPTK2拷贝/mL血浆；灵敏度：0.928；特异性：0.910）。同样，Asel Lubotzky等人招募了65名健康供体、85名局部癌症（非肝脏）患者、55名非肝脏转移性癌症患者和63名有肝脏转移的癌症患者，以验证基于cfDNA PCR测序分析的检测方法在区分肝脏转移方面的表现。结果表明，通过这种方法检测到的肝细胞的AUC浓度为0.81（95%置信区间=0.74–0.87，P= 0.0001）。肝脏转移检测的特异性和灵敏度分别为95%和35%。
临床效用
临床效用是指在考虑PPV（阳性预测值）、NVP（阴性预测值）和成本等因素下，评估患者检测中开发的检测方法的成本效益。临床效用的评估可以考虑多种因素，包括但不限于以下因素。
诊断准确性：评估甲基化检测方法在正确鉴定患者组织或器官损伤方面的灵敏度、特异性、PPV和NPV。临床影响：评估甲基化检测方法对治疗决策和患者管理的影响，例如它是否有助于选择适当的治疗选项、监测治疗反应或预测疾病复发。
成本效益：考虑与甲基化检测过程相关的成本，包括样本收集、实验室检测、数据分析和结果解释，并将其与潜在的益处进行权衡，如改善患者结果、降低医疗保健成本和提高患者满意度。
可行性和可扩展性：评估在临床环境中实施甲基化检测方法的实际可行性，包括样本收集的便利性、所需的实验室基础设施和专业知识，以及扩展到更大患者人群的可扩展性。
比较效果：在准确性、临床影响和成本效益方面，将甲基化检测方法与现有的标准诊断方法或替代方法进行比较。
伦理和法律考虑：在评估临床效用时，考虑伦理和法律考虑因素，如患者隐私、知情同意和遵守监管要求。
总之，鉴定与组织和器官损伤相关的特定甲基化标记物，并将其应用于临床检测，需要一种严格和系统的方法，涉及多个研究、验证和检测阶段。然而，值得注意的是，目前使用甲基化分析进行组织损伤检测仍处于研究的早期阶段，迄今为止，尚未进行临床研究，也未在临床环境中实施任何商业产品。
研究人员、临床医生和行业伙伴之间的合作对于确保基于甲基化的诊断检测方法的成功开发和临床应用非常必要。
挑战和未来方向
结合之前的讨论，研究甲基化标记物在组织和器官损伤中的应用存在一些挑战。挑战和未来的研究方向包括：
个体之间甲基化模式的变异性
根据之前的大量研究，DNA甲基化模式在个体之间差异很大，并且与性别、生活环境和许多其他因素有关。因此，在临床上使用DNA甲基化分析来检测组织损伤仍然存在许多困难。这一挑战的一个潜在解决方案是使用大规模研究来确定跨人群一致的甲基化模式，而不是依赖于单个标记。这种方法可以帮助鉴定不同个体之间常见的甲基化模式，并且可以用作鉴定与不同组织或器官相关的甲基化变化的参考。通过鉴定这些常见模式，研究人员可以减少个体变异性的影响，提高甲基化分析的准确性。另一种方法包括利用机器学习算法来辨别特定类型组织损伤所特有的甲基化模式。这种方法不再仅仅依赖于可能受个体变异性影响的个体标记，而是侧重于能够提供更稳健和可靠见解的综合模式。这种方法可以帮助鉴定与特定类型的组织损伤或疾病相关的甲基化变化。通过关注特定的甲基化模式，研究人员可以减少个体变异性的影响，提高甲基化分析的准确性。
外部因素对甲基化模式的影响
由于外部因素对DNA甲基化模式的影响，这种影响可能会干扰组织和器官损伤筛查，诊断和治疗的决策。未来的研究可以集中在鉴定和调控可能影响甲基化模式的外部因素，如生活方式因素和环境暴露。可以通过收集有关这些因素的详细信息的大规模人群研究以及使用动物模型研究特定暴露对甲基化模式影响的实验研究来完成。例如，当Kang Li研究HBV与相关慢性肝炎之间的关系以及外周免疫系统的甲基化时，发现外周免疫系统的甲基化模式受到外部因素的影响。因此，他们将Bonferroni校正应用于代偿性肝硬化预测模型构建中的潜在混杂因素，并发现了真正显著的相关性。
检测方法的技术局限性和不一致性
现有的甲基化检测方法也存在技术缺陷，例如灵敏度和特异性问题。该领域的研究可以集中于开发更灵敏和更具体的检测甲基化变化的方法。这可能包括使用纳米孔测序和单细胞测序等新技术，以及开发用于分析甲基化数据的改进生物信息学工具。此外，研究可以集中于鉴定和解决现有甲基化检测方法的技术局限性。例如，亚硫酸盐测序是检测DNA甲基化最常用的方法，由于亚硫酸盐处理过程中未甲基化C和DNA损伤的不完全转化，可能会产生偏差和不准确。解决这些问题的新方法，例如使用替代化学处理或改进的酶转化方法，可以提高甲基化检测的准确性和可靠性。此外，研究可以调查技术因素对甲基化分析的影响，例如DNA质量和数量，测序深度和文库制备方法。鉴定和减轻这些因素可以帮助减少变异并提高甲基化研究的可重复性。
结论与展望
甲基化检测方法在各种情况下表现出检测器官和组织损伤方面的巨大潜力。这些检测有望检测早期损伤、监测组织和器官损伤的进展，评估治疗效果和预测移植结果。然而，仍有一些挑战需要克服，包括甲基化模式的变异性，可能影响甲基化模式的外部因素以及检测方法的技术局限性。尽管存在这些挑战，但人们对这一领域产生了浓厚的兴趣，正在进行的研究继续确定有前途的标记物，并开发有效的诊断和监测工具。随着技术的不断进步和DNA甲基化模式的更好理解，基于甲基化的检测有可能通过分析血液或其他体液来显著改善临床环境中器官和组织损伤的诊断和管理，这将显著改善患者获得诊断测试和监测。使用基于DNA甲基化的检测来预测对不同治疗的反应，可以为器官和组织损伤提供个性化医疗方法。研究表观遗传变化（包括DNA甲基化）在器官和组织损伤的发展和进展中的作用，也将为疾病机制和潜在的新治疗靶点提供见解。
技术推介
易基因微量cfDNA甲基化测序（cfDNA-BS）技术
cfDNA片段化严重，片段大小常在150bp左右，现有甲基化检测技术包括cfMeDIP和微量WGBS等。无法做到碱基分辨、具有抗体特异性和非特异性捕获、覆盖深度低、检测成本高等特点。常规RRBS富集约70-350bp范围酶切片段，如对于CG含量高的片段将被切割的更碎而无法检测，保留下来的片段反而是CG含量低，无甲基化信息的基因片段。
易基因研发cfDNA-RBS技术，特异性捕获CCGG位点两端的DNA，通过亚硫酸盐测序，实现高深度，单碱基分辨检测CG位点甲基化信息。DNA起始量仅需1ng，是目前肿瘤甲基化标志物检测研究的优选技术。
技术优势：
- 超低起始量：100-500ul血浆或1ng cfDNA；
- 测序覆盖度高：20G测序数据，可达10M的CG位点覆盖，涵盖CpG岛、启动子、增强子、CTCF结合位点等多种核心调控区域
- 单碱基分辨率：在其覆盖范围内可精确分析每一个C碱基的甲基化状态；
- 性价比高：成本相对于现有技术大幅降低。
技术指标：
应用场景：
- 癌前病变的癌变预警标志物检测
- 肿瘤早期筛查标志物检测
- 肿瘤预后标志物检测
- 药物疗效预测标志物检测
易基因科技提供全面的DNA甲基化研究整体解决方案，详询易基因：0755-28317900。
参考文献：Zhang L, Li J. Unlocking the secrets: the power of methylation-based cfDNA detection of tissue damage in organ systems. Clin Epigenetics. 2023 Oct 19;15(1):168. pii: 10.1186/s13148-023-01585-8. doi: 10.1186/s13148-023-01585-8. PubMed PMID: 37858233.
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