易基因：MeRIP-seq等揭示ALKBH5介导m6A去甲基化调控皮肤创面再上皮化分子机制
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哺乳动物的损伤皮肤屏障完整性恢复通过创面愈合基本机制实现，这是一个包括凝血、炎症、再上皮化（re-epithelialization）、肉芽组织形成和疤痕重塑的多步骤过程。再上皮化是决定创面成功愈合的重要因素，再上皮化受损是创伤、糖尿病、血管疾病、感染或辐射导致的所有慢性创面无法愈合的原因。因此研究创面再上皮化调控机制具有重要的临床意义，并可能为加速创面愈合的治疗策略提供新的见解。
N6-甲基腺苷（m6A）是真核生物中最普遍的内部mRNA修饰，哺乳动物m6A修饰受“writers”（如METTL3、METTL14、WTAP）和“erasers”（如FTO、ALKBH5））的动态和可逆调控。同时m6A修饰可以被特异性RNA结合蛋白识别（称为“readers”，如YTHDF1-3、HNRNP、IGF2BP）。m6A修饰被“readers”蛋白识别后，可以影响RNA代谢的各个方面，包括RNA稳定性、翻译、剪接、易位和高级结构。近年来大量研究表明m6A修饰广泛参与毛囊形态发生、紫外线介导的皮肤损伤、系统性硬化、寻常型银屑病、增生性瘢痕和肿瘤发生的调控。同时，m6A修饰在创面愈合过程中也发挥着重要作用，然而m6A修饰是否在调控角质形成细胞的迁移能力中发挥作用仍不清楚。此外对m6A修饰在创面再上皮化中的作用缺乏全面了解。
2023年7月14日，上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科Xin Huang、Yixuan Zhao、湖南中医药大学附属第二医院创面修复科刘代明为共同第一作者，上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科昝涛、李青峰、Yixuan Zhao为共同通讯作者， 以“ALKBH5-mediated m6A demethylation fuels cutaneous wound re-epithelialization by enhancing PELI2 mRNA stability”为题在《Inflammation and Regeneration》杂志发表研究论文，该研究通过甲基化RNA免疫沉淀测序（MeRIP-seq）和对应的RNA-seq联合分析揭示了ALKBH5是创面再上皮化的内源性促进因子，提示了开发针对难治性创面的重编程m6A靶向疗法的前景。
标题：ALKBH5-mediated m6A demethylation fuels cutaneous wound re-epithelialization by enhancing PELI2 mRNA stability（ALKBH5介导的m6A去甲基化通过增强 PELI2 mRNA 稳定性促进皮肤创面再上皮化）
时间：2023-07-14
期刊：Inflammation and Regeneration
影响因子：IF 8.1
技术平台：m6A-seq（MeRIP-seq）、RNA-seq、m6A-RIP-qPCR 、qRT-PCR、Dot-blot、WB/IF等
研究摘要：
创面再上皮化受损会导致皮肤屏障重建功能障碍。m6A RNA修饰参与RNA命运决定，m6A甲基化变异会触发许多疾病发病机制。然而，m6A在创面再上皮化中的作用仍然未知。本研究构建ALKBH5-/-小鼠以研究ALKBH5敲除后创面再上皮化率。采用甲基化RNA免疫沉淀测序（MeRIP-seq）和RNA-seq结合的高通量测序分析方法鉴定出ALKBH5的下游靶标。通过体外和体内挽救实验（In vitro and in vivo rescue experiments）验证下游靶标对ALKBH5缺失细胞或动物的功能表型作用。此外，通过RIP-qPCR、RNA下拉和RNA稳定性分析揭示了互作的reader蛋白和调控机制。
研究结果表明，ALKBH5在创缘表皮中特异性上调。ALKBH5敲除抑制了ALKBH5-/-小鼠的角质形成细胞（keratinocytes）迁移，并导致创面再上皮化延迟。综合高通量分析揭示E3泛素蛋白连接酶PELI2是ALKBH5的下游靶标。体外和体内挽救实验结果表明，外源性PELI2补充可以在体内和体外部分挽救ALKBH5缺失细胞中的角质形成细胞迁移并加速再上皮化。从机制上来说，ALKBH5通过去除PELI2 mRNA中的m6A修饰来促进PELI2表达，并以YTHDF2依赖的方式增强其稳定性。
图形摘要
研究结果
（1）在创缘的角质形成细胞（keratinocytes）中观察到RNA m6A修饰减少和ALKBH5表达增加
图1：健康创面边缘角质形成细胞中RNA m6A修饰降低，ALKBH5表达增加。
- 在小鼠背部产生直径5 mm的全层皮肤创面，切除肉脂膜下方筋膜(红虚线)以防止创面收缩。
- 伤后2 d (PWD2)皮肤创面大体外观及组织学。勾画创面床、创缘及邻近正常皮肤。比例尺:250 μm。
- m6A-DB分析从创面边缘皮肤和邻近正常皮肤提取mRNA的整体m6A水平。亚甲基蓝(Methylene blue)染色法检测总RNA(作为loading control)。实验重复三次。t检验，双侧*P<0.05。
d.创面边缘和正常皮肤m6A“writer”和“eraser”基因表达的热图。实验设4个生物重复。
e.RNA-seq数据(GSE159939)绘制的m6A“writer”和“eraser”基因在创床和创缘表皮和真皮中的表达热图。
f. IF检测创缘皮肤ALKBH5表达。比例尺:100 μm。
g.统计分析每个HPF中ALKBH5角质形成细胞的百分比。取4只小鼠创面样本，ALKBH5细胞百分比以均数±SD表示。t检验，双侧***P<0.001。
h.代表性临床照片，显示了一组以愈合或难治性不愈合创面为特征的慢性创面患者队列。
- IF检测愈合创面、难愈创面及正常皮肤创面边缘ALKBH5的表达。比例尺:100 μm。
j.统计分析每个HPF中ALKBH5表皮细胞的百分比。分析4例愈合创面、6例难愈创面的创缘及相应的正常皮肤对照。ALKBH5细胞的百分比表示为平均值±SD。单因素方差分析，***P < 0.001。Epi表皮。虚线表示表皮边界++++
（2）ALKBH5抑制降低角质形成细胞的迁移
图2：抑制ALKBH5可在体外破坏角质形成细胞迁移。
a-b. 通过qRT-PCR (a)和WB (b)验证，siRNA转染后，HaCaT细胞中的ALKBH5表达降低。实验重复3次。单因素方差分析 ***P < 0.001。
c. 从ALKBH5敲低组和对照组的HaCaT细胞中提取RNA，通过m6A-DB检测siRNA转染后的整体m6A水平。亚甲基蓝染色法检测总RNA(作为对照)。
d. Transwell实验分析ALKBH5敲低组和对照组HaCaT细胞的迁移能力。比例尺:25 μm。
e. Transwell实验的统计分析。所有实验重复3次，共纳入5个随机字段进行分析。迁移细胞面积的百分比用平均值±SD表示。单因素方差分析，***P < 0.001。
f. 采用细胞跟踪成像技术绘制ALKBH5敲低或对照HaCaT细胞划痕实验后0 h、2 h、16 h、32 h的代表性动态细胞速度图。x方向速度为u, y方向速度为v。速度大小表示u和v的合成速度，速度的方向和大小分别用黑色箭头和颜色密度表示。FC相位对比图像。比例尺:250 μm。
g. 不同时间点ALKBH5敲低组和对照组HaCaT细胞的速度大小的统计分析。
h. 统计分析划痕创面愈合率。所有实验重复三次。
- 通过划痕实验评估HaCaT细胞的长期迁移能力。比例尺:100 μm。
j. 创面愈合实验的统计学分析。所有实验重复3次，每个时间点纳入3个随机字段进行分析。单因素方差分析，***P < 0.001
（3）ALKBH5敲除可抑制小鼠创面再上皮化
图3：ALKBH5缺失会抑制小鼠创面的再上皮化。
a .使用CRISPR/Cas9技术敲除ALKBH5基因的策略示意图。
b-c. WB (b)和IF (c)分别证实ALKBH5-/-小鼠皮肤和表皮中ALKBH5表达缺失。
d. m6A-DB分析WT和ALKBH5-/-小鼠创面边缘皮肤的整体m6A水平。亚甲基蓝染色法检测总RNA(作为装载对照)。实验重复三次，m6A修饰的相对含量以平均值±SD表示。t检验，双侧*P<0.05。
e. IF分析揭示ALKBH5 -/-小鼠创面边缘表皮中ALKBH5表达缺失。比例尺:100 μm。虚线表示表皮边界。Epi表皮。
f-g. WT和ALKBH5-/-小鼠在PWD0、PWD2、PWD4、PWD6、PWD8上的皮肤创面代表性图像(f)。比例尺:2 mm。黑色虚线圆描绘了5mm宽的原始创面。创面闭合率(g)通过ImageJ软件进行量化，并表示为不愈合区域的百分比。6只小鼠的12个创面纳入分析。创面闭合的相对百分比以平均值±SD表示。t检验，双侧**P<0.01， ***P<0.001。
h-i. PWD8时WT和ALKBH5-/-小鼠创面再上皮化的组织学分析(h)。箭头线表示原创面间隙宽度为5 mm。钝端线描绘上皮间隙，代表非上皮化的创面区域。比例尺:1mm。在PWD8时对WT和ALKBH5-/-小鼠的再上皮化百分比进行定量分析(i)。6只小鼠的12个创面纳入分析。再上皮化创面面积的相对百分比以均数±SD表示。Mann-Whitney检验，双侧****P< 0.0001。比例尺:1mm。虚线表示表皮边界
（4）全基因组MeRIP-seq和RNA-seq鉴定出PELI2是ALKBH5的下游靶标
图4：在人表皮样本和角质形成细胞系中受ALKBH5调控的m6A修饰基因表征
- m6A修饰下游分析流程图。MeRIP-seq鉴定出人类表皮样本和角质形成细胞系共有的3710个基因，在3'UTR中具有特异性m6A peaks。RNA-seq在 ALKBH5敲低后鉴定出306个下调基因；以|FC|<0.5和P <0.05定义为差异表达基因。FC fold change。最终鉴定出16个同时具有m6A peaks和差异表达候选基因作为ALKBH5的潜在下游靶点。
- 3710个共有基因的GO富集分析图谱。
- 由IPA产生的PELI2和其他15个候选基因的调控网络。未显示C3orf33、PGBD2、ZNF20、ZNF573、ZNF577和ZNF785基因，因为它们与PELI2没有通路连接。
- qRT-PCR检测ALKBH5敲低后16个候选基因的表达。实验重复3次，mRNA的相对表达量以平均值±SD表示。单因素方差分析，*P<0.05;** p<0.01。
- IGV轨迹显示人表皮和HaCaT中PELI2的MeRIP-seq reads覆盖。
- m6A-RIP-qPCR检测证实PELI2转录本的m6A修饰。实验重复三次。将抗m6A抗体组和IgG组的mRNA相对表达量进行比较，以均数±SD表示。单因素方差分析，**P<0.01
(5) ALKBH5调控m6A甲基化和PELI2表达
图5：ALKBH5表达水平与PELI2表达水平呈正相关。
- 根据ALKBH5敲低或对照HaCaT细胞的RNA-seq分析，IGV追踪PELI2表达。实验设置两个重复。
- WB敲低ALKBH5后，检测HaCaT细胞PELI2蛋白表达。
- 通过IF染色分析PWD8中的WT和ALKBH5-/-小鼠创缘皮肤PELI2表达。虚线表示表皮边界。比例尺:100 μm。
- qRT-PCR显示PELI2在WT和ALKBH5-/-小鼠原代角质形成细胞中的mRNA表达。实验重复3次，mRNA相对表达量以平均值±SD表示。t检验，双侧**P<0.01。
- 采用IF染色分析PWD6时WT小鼠创缘表皮PELI2和ALKBH5的表达及共定位情况。比例尺:100 μm。
- IGV轨迹显示ALKBH5敲低后PELI2的MeRIP-seq reads覆盖情况。实验设置2个重复。
- 通过基因特异性m6A-RIP-qPCR检测HACAT细胞中ALKBH5敲低后PELI2转录本的m6A修饰增加。实验重复3次，将每组mRNA的相对表达量与input值进行比较，以平均值±SD表示。单因素方差分析，ns不显著，*P<0.05，****P<0.0001
（6）外源性PELI2过表达可挽救ALKBH5缺失后延迟的创面再上皮化
图6：外源性PELI2过表达挽救了ALKBH5敲低对角质形成细胞迁移的影响。
a-b. qRT-PCR显示在用ALKBH5或NC siRNA处理并用PELI2或NC质粒转染48h后的HaCaT细胞中PELI2（a）和ALKBH5（b）的mRNA表达。实验重复3次，mRNA的相对表达量以平均值±SD表示。单因素方差分析，ns不显著，*P<0.05，****P<0.0001。
c. WB检测ALKBH5和PELI2的蛋白表达。
d. Transwell实验显示外源性PELI2过表达对ALKBH5敲低或对照HaCaT细胞迁移的影响。比例尺:25 μm。
e. 对Transwell实验结果进行统计学分析。所有实验重复3次，共纳入5个随机字段进行分析。迁移细胞的百分比面积表示为平均值±SD。单因素方差分析，***P<0.001。比例尺:25 μm。
f. 采用划痕实验评估外源性PELI2过表达对ALKBH5敲低或对照HaCaT细胞迁移的影响。比例尺:100 μm。
g.创面划痕实验的统计学分析。所有实验重复3次，每个时间点的3个随机字段纳入分析。Mann-Whitney检验(24 h)， ALKBH5-si1 + p-PELI2组与ALKBH5-si1 + p-NC组、ALKBH5-si2 + p-PELI2组与ALKBH5-si2 + p-NC组比较，差异均无统计学意义(p>0.05)。单因素方差分析(48 h, 72 h)，***P<0.001
图7：外源性PELI2过表达挽救了ALKBH5敲低对再上皮化和创面愈合的影响。
- 创面建立后d0和d1, WT和ALKBH5-/-小鼠创缘皮肤皮内注射Lv-PELI2和Lv-NC (1×107 TU/ml, 1% Lipo3000)示意图。于PWD8时处死小鼠。
- qRT-PCR证实ALKBH5-/-小鼠创缘皮肤PELI2 mRNA表达恢复。5只小鼠的5个创面纳入分析。基因的相对表达水平以平均值±SD表示。单因素方差分析，*P<0.05，**P<0.01。
- IF分析证实Lv-PELI2转染后ALKBH5-/-小鼠创缘表皮PELI2表达恢复。虚线表示表皮边界。Epi表皮。比例尺:25 μm。
d-e. Lv-NC转染的WT小鼠以及Lv-PELI2或Lv-NC转染的ALKBH5-/-小鼠在PWD0、PWD2、PWD4、PWD6、PWD8的皮肤创面代表性图像。比例尺:2mm。黑色虚线圆圈绘制了5 mm宽的原始创面。采用ImageJ软件对创面闭合率(e)进行量化，e表示为创面未愈合面积的百分比。5只小鼠的10个创面纳入分析。创面闭合的相对百分比以平均值±SD表示。单因素方差分析(第2天，第4天，第6天)，***P < 0.001。Mann-Whitney检验(第8天)，双侧*P< 0.05 (KO + Lv-PELI2 vs. KO + Lv-NC)。
f-g. 用Lv-NC转染的WT小鼠和用Lv-PELI2或Lv-NC转染的ALKBH5-/-小鼠在划痕实验后第8天的创面再上皮化组织学分析(f)。箭头线表示原创面间隙宽度为5mm。钝端线描绘了上皮间隙，表示非上皮化创面宽度。再上皮化百分比定量(g)。5只小鼠的10个创面纳入分析。再上皮化创面的相对百分比以均数±SD表示。Mann-Whitney检验，双侧**P<0.01,****P<0.0001。虚线表示表皮边界。比例尺:200 μm
（7）ALKBH5以YTHDF2依赖性方式稳定PELI2 mRNA表达
图8：YTHDF2与m6A修饰结合并稳定PELI2 mRNA。
- RIP-qPCR分析显示YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3在PELI2转录本中富集。实验设置4个重复，mRNA的相对表达量与input值进行比较，用平均值±SD表示。单因素方差分析，****P<0.0001。
- 用于RNA下拉分析的RNA探针示意图。
- 使用带有或不带有m6A修饰的PELI2 RNA探针，从细胞提取物中RNA下拉内源性YTHDF2蛋白。实验设置3个重复。
d-e. 通过qRT-PCR (d)和WB (e)评估ALKBH5和YTHDF2敲低组或对照组HaCaT细胞中的PELI2表达。实验进行3个重复。对PELI2的mRNA相对表达水平进行定量分析，并以平均值±SD表示。单因素方差分析，*P<0.05，**P<0.01。
f. 用放线菌素D (5 μg/mL)处理ALKBH5和YTHDF2敲除或对照HaCaT细胞0h、2 h、4 h、6 h、8 h， qRT-PCR分析PELI2的mRNA表达。实验重复三次。
g. m6A eraser蛋白ALKBH5上调介导m6A甲基化降低如何通过YTHDF2依赖性方式增强PELI2 mRNA的稳定性来促进创面再上皮化示意图
研究结论
本研究通过MeRIP-seq和对应的RNA-seq等分析揭示了创面再上皮化的一种新机制，通过该机制，m6A eraser蛋白ALKBH5在创缘被特异性激活，并通过从PELI2 mRNA中去除m6A位点并保护其免受YTHDF2介导的降解来促进角质形成细胞迁移。本研究从RNA表观转录组调控角度拓展了对创面再上皮化的理解。重要的是，ALKBH5和PELI2可能是开发针对难愈性创面患者的重编程m6A靶向治疗的潜在治疗靶点。
关于易基因RNA m6A甲基化测序(MeRIP-seq)技术
易基因MeRIP-seq技术利用m6A特异性抗体富集发生m6A修饰的RNA片段（包括mRNA、lncRNA等rRNA去除所有RNA），结合高通量测序，可以对RNA上的m6A修饰进行定位与定量，总RNA起始量可降低至10μg，最低仅需1μg总RNA。广泛应用于组织发育、干细胞自我更新和分化、热休克或DNA损伤应答、癌症发生与发展、药物应答等研究领域；可应用于动物、植物、细胞及组织的m6A检测。
大样本量m6A-QTL性状关联分析，传统MeRIP单个样品价格高，通常难以承担。易基因开发建立MeRIP-seq2技术，显著提成IP平行性，实现不同样本间相对定量，降低检测成本。
易基因提供适用于不同科研需求的MeRIP技术：
- m6A甲基化-常量mRNA 甲基化测序（MeRIP-seq）
- m6A甲基化-常量mRNA +lncRNA甲基化测序（lnc-MeRIP-seq）
- m6A甲基化-微量mRNA +lncRNA甲基化测序（Micro-lnc-MeRIP-seq）
- 高通量m6A甲基化-常量mRNA甲基化测序（MeRIP-seq2）
技术优势：
- 起始量低：样本起始量可降低至10-20μg，最低仅需1μg总RNA；
- 转录组范围内：可以同时检测mRNA和lncRNA；
- 样本要求：可用于动物、植物、细胞及组织的m6A检测；
- 重复性高：IP富集重复性高，最大化降低抗体富集偏差；
- 应用范围广：广泛应用于组织发育、干细胞自我更新和分化、热休克或DNA损伤应答、癌症的发生与发展、药物应答等研究领域。
研究方向：
m6A甲基化目前主要运用在分子机制的理论性研究
- 疾病发生发展：肿瘤、代谢疾病（如肥胖/糖尿病）、神经和精神疾病（如阿尔兹海默症/抑郁症）、炎症…
- 发育和分化：早期胚胎发育、个体/组织/器官生长发育、干细胞分化与命运决定、衰老
- 环境暴露与响应：污染、抗逆、生活方式
关于m6A甲基化研究思路
（1）整体把握m6A甲基化图谱特征：m6A peak数量变化、m6A修饰基因数量变化、单个基因m6A peak数量分析、m6A peak在基因元件上的分布、m6A peak的motif分析、m6A peak修饰基因的功能分析
（2）筛选具体差异m6A peak和基因：差异m6A peak鉴定、非时序数据的分析策略、时序数据的分析策略、差异m6A修饰基因的功能分析、差异m6A修饰基因的PPI分析、候选基因的m6A修饰可视化展示
（3）m6A甲基化组学&转录组学关联分析：Meta genes整体关联、DMG-DEG对应关联、m6A修饰目标基因的筛选策略
（4）进一步验证或后期试验
易基因科技提供全面的RNA甲基化研究整体解决方案。
参考文献：
Huang X, Zhao Y, Liu D, Gu S, Liu Y, Khoong Y, Luo S, Zhang Z, Xia W, Wang M, Liang H, Li M, Li Q, Zan T. ALKBH5-mediated m6A demethylation fuels cutaneous wound re-epithelialization by enhancing PELI2 mRNA stability. Inflamm Regen. 2023 Jul 14;43(1):36.
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