全基因组DNA甲基化和转录组分析揭示绵羊羊毛类型变异的关键基因｜科研进展

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羊毛纤维是纺织工业的宝贵材料，可分为有髓毛（粗羊毛，ALC）和无髓毛（细羊毛，MF），有髓毛由初级毛囊产生，无髓毛由初级或次级毛囊产生。决定羊毛毛囊类型的关键时期是胚胎期，这限制了表型观察和变异对比，导致羊毛类型变异的选择和研究相当困难。DNA甲基化、重塑、组蛋白修饰、染色质microRNA和长链非编码RNA等不同机制的表观基因组，与营养、病原体、气候等环境因素互作，影响基因的表达谱和特定表型。先前研究发现，绵羊细毛羊的IRF2BP2基因等是细毛羊中的关键基因，但几乎所有基因变异均基于基因组变异。尽管有一些与羊毛发育相关的表观遗传学研究，但与羊毛发育相关的关键表观遗传调控位点很少被报道。

2023年7月8日，中国农业大学动科院邓学梅教授团队在《J Anim Sci Biotechnol》杂志发表了题为“Genome-wide DNA methylation and transcriptome analyses reveal the key gene for wool type variation in sheep”的研究论文，该研究从相同基因组背景的同一家族中选择三对全/半同源的ALC和MF毛羊的采集皮肤组织提取DNA和RNA进行WGS、WGBS、RNA-seq测序分析，揭示了绵羊羊毛类型变异的关键基因。

标题：Genome-wide DNA methylation and transcriptome analyses reveal the key gene for wool type variation in sheep（全基因组DNA甲基化和转录组分析揭示了绵羊羊毛类型变异的关键基因）

时间：2023-07-08

期刊：Journal of Animal Science and Biotechnology

影响因子：IF 7

技术平台：WGS、WGBS、mRNA-seq、RT-qPCR、Western Blot等

 

研究摘要：

本研究在采用多次排卵和胚胎移植技术（multiple-ovulation and embryo transfer，MOET）培育现代细毛羊(MF)品种的过程中，偶然发现有髓毛羊（ALC）。全基因组重测序（WGS）证实ALC羊毛是MF羊毛的变异类型。作者使用全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）在4号染色体上定位了显著相关的甲基化位点，进而将SOSTDC1基因鉴定为ALC羊毛与其半/全同源MF羊毛相比的高甲基化外显子。转录组测序（RNA-seq）结果表明，SOSTDC1在ALC羊毛中表达是MF的数十倍，且在所有差异表达基因中居首位。对粗/细羊毛品种绵羊的转录组比较分析，表明ALC/MF羔羊出生后的差异表达基因和富集通路与羔羊胚胎阶段的差异表达基因和富集通路高度相似。进一步实验证实，SOSTDC1基因在初级毛囊毛乳头的细胞核中特异性高表达。

本研究对差异羊毛类型性状进行了全基因组差异甲基化位点关联分析，并鉴定出唯一与初级毛囊发育密切相关的CpG位点。结合转录组分析，SOSTDC1被鉴定为该位点上唯一在ALC羊毛羔羊初级毛囊干细胞中特异性过表达基因。这一关键基因及其表观遗传学调控的发现有助于理解细毛羊的驯化和育种。

 

材料方法

以中国Merino山羊的亲缘品种Aohan细毛羊为供体，采用多次排卵和胚胎移植(MOET)法产生ALC和MF羊毛羊羔。从两个家族共发现4只ALC毛羔羊，其中一只公羊和两只母羊的三只ALC雌性羊羔和三只MF雌性羊羔的皮肤组织用于随后的WGS、WGBS和RNA-seq分析，并用于不同组织的表型测定和基因表达分析。给予相同的生长环境和饲养条件，在30日龄时，采集每只羔羊中间背侧的羊毛纤维，测定羊毛直径。采集羔羊中间背侧1平方厘米皮肤组织，立即用液氮冷冻提取总DNA和RNA，制备皮肤组织冷冻切片。

 

研究结果

（1）ALC和MF羊毛羔羊的表型比较

图1：在细毛羊群体中发现ALC羊毛羔羊。

  1. 在P30中出现ALC和MF毛羊羔。
  2. MF毛羊羔的羊毛纤维。
  3. MF羔羊皮的横截面和随后的HE染色。
  4. ALC毛羊羔的羊毛纤维。
  5. ALC羔羊皮的横截面和随后的HE染色。C和E中的横排为180μm。
  6. ALC和MF羊毛直径的分布。
  7. ALC和MF羊毛型羔羊初级和次级毛囊直径的比较分析。P：初级毛囊，S：次级毛囊。P<0.001.
  8. ALC和MF羊毛型羔羊S/P比的比较分析。S/P：次级毛囊数量与初级毛囊数量比。P<0.001

 

（2）WGBS揭示SOSTDC1是与ALC羊毛类型相关的关键基因

图2：通过全基因组甲基化测序（WGBS）揭示关键基因。

  1. 根据全基因组重测序数据构建不同绵羊品种间的系统发育树。
  2. ALC和MF组WGBS数据的主成分分析（PCA）。
  3. ALC与MF羔羊中差异甲基化CpG的曼哈顿图。
  4. 4号染色体和SOSTDC1基因上差异甲基化CpG位点的分布。
  5. 基于WGBS和在线预测工具的结果构建了SOSTDC1基因甲基化模式图谱

 

（3）转录组分析（RNA-seq）揭示ALC羊毛类型的关键通路

图3：转录组学数据揭示ALC羊毛性状的关键信号。

  1. ALC和MF羊毛羔羊RNA-seq数据的主成分分析（PCA）。
  2. ALC羔羊中高甲基化基因和上调的DEG之间的重叠基因。
  3. ALC和MF羊毛羊皮中DEG的GO分析和KEGG通路分析。底部X轴表示由相应的基因GO分析和KEGG通路富集分析的P值的负对数（经典Fisher t检验）；顶部X轴显示计数级别，也以红色虚线显示。
  4. ALC羊毛羊皮的关键候选基因表达

 

（4）ALC羔羊与现代粗毛羊品种的比较

图4：利用转录组公开数据分析粗羊毛和细羊毛品种不同发育阶段的皮肤组织差异表达基因。

  1. 粗羊毛品种和细羊毛品种的RNA-seq数据分析工作流程。（I）Fastq数据检查和质控（II）reads比对和计数（III）基因差异表达分析。
  2. 不同品种和不同时期绵羊所有表达基因的PCA分析。
  3. 粗羊毛和细羊毛品种三个阶段的DNMT3A、ARID4A、BRCA1、CTCF基因的TPM平均值条形图。0.01<P< 0.05，P< 0.001。
  4. 粗羊毛和细羊毛品种三个阶段的METTL3、METTL14、FTO、ALKBH5、YTHDF1、YTHDF2和HNRNPA2B1基因的TPM平均值条形图。0.01<P< 0.05，P<0.001。
  5. ALC羊毛羔羊皮中关键表观遗传学调控因子的表达。

图5：ALC和粗毛羊品种粗毛毛囊形态发生的分子机制比较。

  1. 利用ALC羊毛羊皮中上调和下调的差异表达基因在X轴上取P值log10进行GO和KEGG通路富集分析。红色条表示胚胎中上调的差异表达基因，而蓝色条表示出生后或成年阶段上调的差异表达基因。数字表示每次富集的基因数量。
  2. ALC羊毛羔羊和粗毛羔羊品种之间毛囊形态发生过程中上调的DEG重叠。
  3. ALC羊毛羔羊和粗毛羔羊品种之间Wnt信号通路中上调的DEG重叠。
  4. 粗、细毛品种不同发育阶段候选基因的表达分析。0.01<P<0.05，P<0.01，P<0.001。
  5. 使用在线工具（GeneMANIA：)对关键蛋白互作网络进行分析

 

（5）验证SOSTDC1作为羊毛毛囊发育的关键候选基因

图6：SOSTDC1基因表达分析。

  1. SOSTDC1在新生阶段羔羊不同组织中的相对表达（n=3），不同字母表示组织间显著差异（P<0.05）。
  2. SOSTDC1 mRNA在粗毛和细毛羔羊皮肤组织、ALC羔羊之间的相对表达。ALC毛羊羔：有髓毛羊（n=4） ，Tan lambs：1月龄（n=4） ，Ujimqin lambs：1月龄（n = 4） ，Merino lambs：1月龄的Aohan细毛羊（n=4）；MF毛羊羔：ALC细羊毛羊羔的半/全同源（n=4） 。
  3. 使用DANMAN软件对小鼠、绵羊和人类中SOSTDC1蛋白的氨基酸序列比对。
  4. 粗毛和细毛羔羊皮肤组织的SOSTDC1蛋白Western-blot分析。β-actin表示维持蛋白。ALC：有髓毛羊，Tan：Tan羊，Ujimchin：Ujimcchin羊，MF：ALC细毛羊的半同源/全同源，Merino-1和Merino-2表示Aohan细毛羊。
  5. 图像J对D中的Western-blot结果进行灰度分析，0.01<P<0.05。
  6. 免疫荧光法检测ALC羔羊初级毛囊中的SOSTDC1蛋白。左图：SOSTDC1的免疫荧光染色。中图：细胞核用DAPI染色。右图：SOSTDC1（红色）和DAPI染色细胞核（蓝色）的合并免疫荧光图像。

 

研究结论：

本研究通过MOET育种在现代细毛羊种群中发现了有髓毛的新生羔羊（ALC）。使用该模型，发现最强的差异甲基化位点位于SOSTDC1基因的第二外显子，与转录组分析揭示的SOSTDCC1基因的差异表达相对应。验证实验表明，SOSTDC1基因在ALC毛羊毛囊干细胞核中特异性过表达，表明其在初级毛囊发育中的重要性。本研究为表观遗传学在绵毛毛囊发育中的作用及其在毛羊驯化和育种中的作用提供了新的视角。

 

关于易基因全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）

全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS）可以在全基因组范围内精确的检测所有单个胞嘧啶碱基（C碱基）的甲基化水平，是DNA甲基化研究的金标准。WGBS能为基因组DNA甲基化时空特异性修饰的研究提供重要技术支持，能广泛应用在个体发育、衰老和疾病等生命过程的机制研究中，也是各物种甲基化图谱研究的首选方法。

易基因全基因组甲基化测序技术通过T4-DNA连接酶，在超声波打断基因组DNA片段的两端连接接头序列，连接产物通过重亚硫酸盐处理将未甲基化修饰的胞嘧啶C转变为尿嘧啶U，进而通过接头序列介导的 PCR 技术将尿嘧啶U转变为胸腺嘧啶T。

 

应用方向：

WGBS广泛用于各种物种，要求全基因组扫描（不错过关键位点）

  • 全基因组甲基化图谱课题
  • 标志物筛选课题
  • 小规模研究课题

 

技术优势：

  • 应用范围广：适用于所有参考基因组已知物种的甲基化研究；
  • 全基因组覆盖：最大限度地获取完整的全基因组甲基化信息，精确绘制甲基化图谱；
  • 单碱基分辨率：可精确分析每一个C碱基的甲基化状态。

易基因科技提供全面的DNA甲基化研究整体解决方案，详询易基因：0755-28317900。

参考文献：

Wang J, Hua G, Cai G, Ma Y, Yang X, Zhang L, Li R, Liu J, Ma Q, Wu K, Zhao Y, Deng X. Genome-wide DNA methylation and transcriptome analyses reveal the key gene for wool type variation in sheep. J Anim Sci Biotechnol. 2023 Jul 8;14(1):88.

 

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posted @ 2023-07-25 11:23  深圳市易基因科技  阅读(108)  评论(0)  编辑  收藏  举报