易基因｜m6A去甲基化酶ALKBH5通过降低PHF20 mRNA甲基化抑制结直肠癌进展 | 肿瘤研究
易基因｜m6A去甲基化酶ALKBH5通过降低PHF20 mRNA甲基化抑制结直肠癌进展 | 肿瘤研究
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2022年8月17日，北京大学人民医院胃肠外科申占龙教授课题组在《Clin Transl Med》杂志发表了《N6‐methyladenosine demethylase ALKBH5 suppresses colorectal cancer progression potentially by decreasing PHF20 mRNA methylation》的研究论文，该研究通过MeRIP-seq等技术揭示ALKBH5可能通过降低PHF20 mRNA甲基化来抑制结直肠癌进展。
标题：N6‐methyladenosine demethylase ALKBH5 suppresses colorectal cancer progression potentially by decreasing PHF20 mRNA methylation
时间：2022.08.17
期刊：CLINICAL AND TRANSLATIONAL MEDICINE
影响因子：IF 8.554
技术平台：MeRIP-seq（m6A-seq）、mRNA-seq
样本：
MeRIP-seq：6个CRC患者肿瘤组织（实验组）+ 6个肿瘤附近正常组织（对照组）
RNA-seq：2个ALKBH5敲除的LOVO细胞系 + 2个对照细胞系
研究思路：
背景意义：
作为最常见的恶性肿瘤之一，结直肠癌（colorectal cancer，CRC）发病率居全球第三位，死亡率居全球第二位。尽管结直肠癌 (CRC) 的综合治疗方法有所改进，但其预后仍然很差。结直肠癌进展的分子机制有待进一步探讨。
作为最广泛的 mRNA 修饰，N6-甲基腺苷 (m6A) 受到甲基转移酶和去甲基化酶的动态可逆调节。ALKBH5 是一种主要的去甲基化酶，在癌症的进展中起着至关重要的作用。然而，ALKBH5在结直肠癌 (CRC) 中的作用和机制尚不清楚。
研究亮点：
（1）ALKBH5在CRC中表达下调，并发挥关键的肿瘤抑制作用。
（2）ALKBH5通过敲除m6A修饰抑制PHF20 mRNA的稳定性。
（3）靶向ALKBH5介导的PHF20 mRNA m6A修饰可能是一种有前途的CRC干预和治疗策略。
结果图形
（1）ALKBH5在CRC中表达下调
图1：ALKBH5在结直肠癌（CRC）中表达下调
- 癌症基因组图谱 (TCGA) 数据库中23种实体癌中的ALKBH5 mRNA表达。
- 基因表达综合 (GEO) 数据库中CRC的ALKBH5 mRNA 表达。
- 24 对 CRC 肿瘤和邻近正常组织中ALKBH5 mRNA 表达的RT-qPCR分析。
- CRC肿瘤和配对正常组织中 ALKBH5 表达的代表性免疫组织化学染色 (IHC) 图像。
- CRC肿瘤组织 ( n= 114) 和邻近正常组织 ( n= 107)中ALKBH5的IHC评分量化。
- CRC肿瘤组织和邻近正常组织中的N6-甲基腺苷(m6A)mRNA水平的相对定量分析。
（2）ALKBH5缺失预示CRC患者的预后更差
图2：ALKBH5 缺失预示CRC患者的预后更差
- ALKBH5 mRNA表达与转移 (M) 阶段之间的关系。
- ALKBH5 mRNA表达与AJCC阶段之间的关系。
- 基于ALKBH5 mRNA表达的CRC患者总生存期 (OS) 的 Kaplan-Meier 分析。
- ALKBH5蛋白表达与M期的关系。
- ALKBH5 蛋白表达与 AJCC 阶段之间的关系。
- 基于 ALKBH5 蛋白表达的CRC患者OS的 Kaplan-Meier分析。
（3）敲低ALKBH5可促进结肠癌细胞的生长和转移
图3：敲低ALKBH5增强了体外结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭
- 五个结肠癌细胞中的ALKBH5 mRNA 表达。
(B 和 C) 用3种独立的靶向ALKBH5的siRNA感染的LOVO ( B )和RKO ( C )细胞系中ALKBH5 mRNA的表达。
(D 和 E) 用2种独立的ALKBH5敲低慢病毒感染的LOVO ( D )和RKO ( E )细胞系中ALKBH5 mRNA的表达。
(F) 用2种独立的 ALKBH5 敲低慢病毒感染的 LOVO 和 RKO 中的 ALKBH5 蛋白的表达。
(G 和 H) 通过 CCK8 (G) 和克隆形成 (H) 实验测定 ALKBH5 敲低的 LOVO 和 RKO 细胞系的增殖能力。
(I 和 J) 通过Transwell实验测定ALKBH5敲低的LOVO和RKO细胞系的迁移( I )和侵袭( J )能力。
图4：敲低ALKBH5增强了体内结肠癌细胞的增殖
(A 和 B) 肿瘤异种移植模型是使用 ALKBH5 敲低的 LOVO 细胞构建的（n = 5）。
(C) 每 2 天监测一次肿瘤异种移植模型中的肿瘤形成和大小。
(D) 肿瘤重量从处死的小鼠身上测量。
（4）ALKBH5过表达抑制结肠癌细胞生长和转移
图5：ALKBH5过表达抑制体外结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭
(A 和 B) 用 ALKBH5 过表达或对照载体慢病毒感染的 LOVO (A) 和 RKO (B) 细胞系中的 ALKBH5 mRNA 的表达。
(C) 用 ALKBH5 过表达或对照载体慢病毒感染的 LOVO 和 RKO 细胞系中的 ALKBH5 蛋白的表达。
(D 和 E) 通过 CCK8 (D) 和克隆形成 (E) 实验测定 ALKBH5 敲低的LOVO 和 RKO 细胞系的增殖能力。
(F 和 G) 通过transwell 实验测定ALKBH5 敲低的LOVO 和 RKO 细胞系的迁移 (F) 和侵袭 (G) 能力。
图6：ALKBH5过表达抑制体内结肠癌细胞的增殖
(A 和 B) 肿瘤异种移植模型是使用ALKBH5过表达LOVO细胞构建的( n= 5)。
(C) 每 2 天监测一次肿瘤异种移植模型中的肿瘤大小和形成。
(D) 肿瘤重量是从处死的小鼠身上测量的。
（5）ALKBH5靶向PHF20
图7：PHF20是ALKBH5介导的m6A修饰的下游靶点
- 肿瘤组织和肿瘤邻近正常组织的 MeRIP-seq 结果显示了6名结直肠癌 (CRC) 患者中变化的m6A peak分布。
- 六对肿瘤组织和肿瘤邻近正常组织中的 ALKBH5 mRNA 的表达。
(C 和 D） RNA-seq 中ALKBH5 敲低细胞系与对照细胞系的差异表达基因火山图（C）和热图（D）。
(E) MeRIP-seq 和 RNA-seq 数据的联合分析。
(F) 与对照组相比，ALKBH5 敲低细胞系中上调基因的验证。
(G) 与对照组相比，ALKBH5 敲低细胞系中下调基因的验证。
(H) ALKBH5 与癌症基因组图谱 (TCGA) 数据库中的六个候选基因（CCDC69、LITAF、TGFB1I1、PHF20、PLIN3和PCSK7 ）之间的关系。
- PHF20 在 ALKBH5 敲低细胞系和对照细胞系中的蛋白表达。
(J) CRC中的PHF20 mRNA的代表性m6A peak。
（6）ALKBH5缺失增强PHF20 mRNA的稳定性以促进CRC进展
图8：ALKBH5通过降低PHF20mRNA甲基化来抑制结直肠癌（CRC）进展
- ALKBH5 敲低细胞系和对照细胞系中mRNA 的整体m6A水平的相对定量分析。
- MeRIP-qPCR 分析ALKBH5 敲低细胞系和对照细胞系中 PHF20 mRNA的m6A 水平的变化。
- 包含m6A motif或m6A突变(A–T突变)位点的人类 PHF20 3'UTR的荧光素酶报告载体构建。黑色代表A，红色代表 T。
- 共转染含有野生型或突变型PHF20 3'UTR的质粒和含有siNC或siALKBH5的siRNA的293T细胞系的相对荧光素酶活性。
- RT‐qPCR分析ALKBH5被抑制后，放线菌素D ( 5μg / ml )处理LOVO或RKO细胞系后PHF20 mRNA的衰减率。
- –(I) 挽救实验用于确定ALKBH5是否通过调节PHF20对LOVO和RKO细胞系的增殖(F和G)、迁移(H)和侵袭(I)产生影响。
结论：
本研究利用MeRIP-seq和RNA-seq技术，确定了ALKBH5表达在CRC中下调，同时其发挥重要的肿瘤抑制作用。从机制上讲，ALKBH5通过去除m6A修饰来抑制PHF20 mRNA的稳定性。该研究为ALKBH5介导的m6A修饰的抗癌作用提供了新的见解，同时也表明了靶向PHF20 mRNA的ALKBH5介导的m6A修饰可能是干预和治疗CRC的一个有希望的策略。
关于易基因RNA m6A甲基化测序(MeRIP-seq)技术
易基因MeRIP-seq技术利用m6A特异性抗体富集发生m6A修饰的RNA片段（包括mRNA、lncRNA等rRNA去除所有RNA），结合高通量测序，可以对RNA上的m6A修饰进行定位与定量，总RNA起始量可降低至10μg，最低仅需1μg总RNA。广泛应用于组织发育、干细胞自我更新和分化、热休克或DNA损伤应答、癌症发生与发展、药物应答等研究领域；可应用于动物、植物、细胞及组织的m6A检测。
大样本量m6A-QTL性状关联分析，传统MeRIP单个样品价格高，通常难以承担。易基因开发建立MeRIP-seq2技术，显著提成IP平行性，实现不同样本间相对定量，降低检测成本。
易基因提供适用于不同科研需求的MeRIP技术：
- m6A甲基化-常量mRNA 甲基化测序（MeRIP-seq）
- m6A甲基化-常量mRNA +lncRNA甲基化测序（lnc-MeRIP-seq）
- m6A甲基化-微量mRNA +lncRNA甲基化测序（Micro-lnc-MeRIP-seq）
- 高通量m6A甲基化-常量mRNA甲基化测序（MeRIP-seq2）
技术优势：
- 起始量低：样本起始量可降低至10-20μg，最低仅需1μg总RNA；
- 转录组范围内：可以同时检测mRNA和lncRNA；
- 样本要求：可用于动物、植物、细胞及组织的m6A检测；
- 重复性高：IP富集重复性高，最大化降低抗体富集偏差；
- 应用范围广：广泛应用于组织发育、干细胞自我更新和分化、热休克或DNA损伤应答、癌症的发生与发展、药物应答等研究领域。
研究方向：
m6A甲基化目前主要运用在分子机制的理论性研究
- 疾病发生发展：肿瘤、代谢疾病（如肥胖/糖尿病）、神经和精神疾病（如阿尔兹海默症/抑郁症）、炎症…
- 发育和分化：早期胚胎发育、个体/组织/器官生长发育、干细胞分化与命运决定、衰老
- 环境暴露与响应：污染、抗逆、生活方式
关于m6A甲基化研究思路
（1）整体把握m6A甲基化图谱特征：m6A peak数量变化、m6A修饰基因数量变化、单个基因m6A peak数量分析、m6A peak在基因元件上的分布、m6A peak的motif分析、m6A peak修饰基因的功能分析
（2）筛选具体差异m6A peak和基因：差异m6A peak鉴定、非时序数据的分析策略、时序数据的分析策略、差异m6A修饰基因的功能分析、差异m6A修饰基因的PPI分析、候选基因的m6A修饰可视化展示
（3）m6A甲基化组学&转录组学关联分析：Meta genes整体关联、DMG-DEG对应关联、m6A修饰目标基因的筛选策略
（4）进一步验证或后期试验
参考文献：
Zhang Z, Wang L, Zhao L, Wang Q, Yang C, Zhang M, Wang B, Jiang K, Ye Y, Wang S, Shen Z. N6-methyladenosine demethylase ALKBH5 suppresses colorectal cancer progression potentially by decreasing PHF20 mRNA methylation. Clin Transl Med. 2022 Aug;12(8):e940.
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