易基因｜性别分化：DNA甲基化表观遗传调控性别表型可塑性，诱导斑马鱼性别比例失调
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2022年07月15日，《Front Cell Dev Biol》杂志在线发表了题为“Epigenetic Regulation of Phenotypic Sexual Plasticity Inducing Skewed Sex Ratio in Zebrafish”的研究论文，该研究通过简化基因组DNA甲基化测序分析（RRBS）揭示了表观遗传调控性别表型可塑性，诱导斑马鱼性别比例失调。
标题：Epigenetic Regulation of Phenotypic Sexual Plasticity Inducing Skewed Sex Ratio in Zebrafish（表观遗传调控性别表型可塑性，诱导斑马鱼性别比例失调）
时间：2022.07.15
期刊：Frontiers in Cell and Developmental Biology
影响因子：IF 6.081
技术平台：RRBS
样本实验：
图1: 本研究RRBS分析的实验设计和性腺组织样本收集。hpf，受精后小时数；dpf，受精后天数。
背景意义：
性别表型可塑性可以响应环境条件变化，导致性别比例的差异，这种差异将对种群动态产生影响。表观遗传修饰可以调节物种的性别比例变化，其中性别由遗传和环境因素决定。然而，性别比例失衡背后的表观遗传机制所扮演的角色还远不清楚，并且仍然是演化发育生物学争论的对象。
鉴于全球气候变化，以斑马鱼为研究模型动物，研究表观遗传修饰(例如 DNA 甲基化)对热敏感物种的性别可塑性的影响，是非常值得探讨的科学问题。斑马鱼性别偏好比率的表观遗传调控机制尚未被研究。
结果图形
（1）不同斑马鱼性别比率对温度的响应
图2：不同斑马鱼的性别比例。
- 对照组中不同家族性别比率的差异以及每个家族的对照和处理中性别决定个体总数的差异。
- 两个选定家族中对照组和处理组的性别比率：家族5(雌性偏好家族)和家族16(雄性偏好家族)。
a–b两个选定家族的对照组和处理组的雄性比例之间的显著差异。
（2）全基因组 DNA 甲基化图谱及不同实验组的分层
图3：斑马鱼性腺整体DNA甲基化图谱的多维尺度分析( MDS )
（3）雄性偏好和雌性偏好家族中差异甲基化 CpG 位点的研究
图4：雄性偏好和雌性偏好家族斑马鱼性腺的差异甲基化CpG位点（DMCs）。
（4）甲基化 CpG 位点及其相关基因的染色体分布
图5：斑马鱼性腺中差异甲基化 CpG 位点(DMC)的染色体分布。
（5）性别偏好家族中睾丸与卵巢 CpG 差异甲基化位点的研究
图6：在雄性偏好和雌性偏好的斑马鱼家族中，睾丸与卵巢的差异甲基化CpG位点（DMCs）
（6）雄性偏好和雌性偏好家族中与 DNA 甲基化变化相关的基因
图7：与性别偏好家族中睾丸与卵巢中差异显著的甲基化 CpG 位点相关的基因（维恩图、森林图）
图8：与显著差异甲基化CpG位点相关的候选基因在雄性偏好和雌性偏好家族间存在重叠（森林图）
（7）性别偏好斑马鱼家族中差异甲基化启动子的研究
附图1：对照组和处理组中雄性偏好和雌性偏好家族斑马鱼性腺中差异甲基化启动子的概述
附图2：对照组和处理组中雄性偏好和雌性偏好家族睾丸和卵巢差异甲基化启动子的概述
附图3：雄性偏好和雌性偏好家族睾丸和卵巢启动子区域差异甲基化基因的火山图
（8）与启动子DNA甲基化改变相关的基因
图9：性别偏好家族中睾丸和卵巢中启动子区域显著差异甲基化基因（维恩图、柱状图）
图10：与雄性偏好和雌性偏好家族中启动子区域显著差异甲基化相关的候选基因
（9）差异甲基化基因的功能注释分析
图11：雄性偏好家庭VS雌性偏好家族的差异甲基化基因富集的 GO类别和通路
图12：睾丸VS卵巢的差异甲基化基因富集到的 GO类别和通路
结论：
本研究利用RRBS技术，发现雄性偏好家族的 DNA 甲基化比雌性偏好家族的多，睾丸中的甲基化位点比卵巢中的多。在较高的培养温度下甲基化程度高于对照温度。由这些结果得出结论，DNA 甲基化的变化可能会影响性别表型可塑性以响应环境条件的变化。该研究为性别偏好斑马鱼家族的表观遗传机制提供了新的见解，并通过进化发育生物学中性别决定的G × E（基因-环境互作）机制提高了我们对物种性别比例变化的理解。
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简化甲基化测序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing,RRBS)是利用限制性内切酶对基因组进行酶切，富集启动子及CpG岛等重要的表观调控区域并进行重亚硫酸盐测序。该技术显著提高了高CpG区域的测序深度，在CpG岛、启动子区域和增强子元件区域可以获得高精度的分辨率，是一种准确、高效、经济的DNA甲基化研究方法，在大规模临床样本的研究中具有广泛的应用前景。
为适应科研技术的需要，易基因进一步开发了可在更大区域内捕获CpG位点的双酶切RRBS(dRRBS)，可研究更广泛区域的甲基化，包括CGI shore等区域。
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技术优势：
- 起始量：100ng gDNA；
- 单碱基分辨率；
- 多样本的覆盖区域重复性可达到85%-95%、测序区域针对高CpG调控区域，数据利用率更高；
- 针对性强，成本较低；
- 基因组CG位点覆盖高达10-15M，显著优于850K芯片。
应用方向：
RRBS/dRRBS/XRBS广泛应用于动物，要求全基因组扫描（覆盖关键调控位点）的：
- 队列研究、疾病分子分型、临床样本的甲基化 Biomarker 筛选
- 复杂疾病及肿瘤发病机制等甲基化研究
- 模式动物发育和疾病甲基化研究
| 技术参数 | RRBS | DRRBS | cfDNA-RBS | Micro-RBS | sc-RBS |
|---|---|---|---|---|---|
| 原理 | MspI酶切+连接接头 | 多酶切+连接接头 | CCGG邻近片段连接接头 | CCGG邻近片段连接接头 | CCGG邻近片段连接接头 |
| 样本要求 | 1μg | 1μg | 1ng | 1ng | 单细胞/1-10个细胞 |
| 测序数据量 | 10G | 15G | 20G | 20G | 2G |
| 5XCG位点覆盖 | 6M | 8M | 6M | 10M | 4-8M |
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参考文献：
Hosseini S, Trakooljul N, Hirschfeld M, Wimmers K, Simianer H, Tetens J, Sharifi AR, Brenig B. Epigenetic Regulation of Phenotypic Sexual Plasticity Inducing Skewed Sex Ratio in Zebrafish. Front Cell Dev Biol. 2022;10:880779.
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