2022最新：8种常用DNA甲基化测序技术，你知道几个？｜易基因
大家好，这里是专注表观组学十余年，领跑多组学科研服务的易基因。
关于DNA甲基化测序：随着高通量测序技术的发展，我们能够从全基因组水平来分析5'-甲基胞嘧啶及组蛋白修饰等事件，发现很多基因组学研究发现不了的东西，这就是 "DNA甲基化测序"！且近年来测序成本的不断下降及测序技术的迭代更新，DNA甲基化测序方法可选择性更多了。
那么常用的DNA甲基化测序技术有哪些呢？
易基因提供全面的DNA甲基化研究整体解决方案，适用于不同DNA甲基化研究方向。主要包括：
①全基因组DNA甲基化测序（WGBS）
②简化基因组甲基化测序（RRBS/dRRBS/XRBS）
③高通量单细胞甲基化测序（sc-RBS）
④靶基因DNA甲基化测序（Target-BS/LHC-BS/Capture-BS）
⑤精准DNA甲基化/羟甲基化测序（oxBS-seq）
⑥单细胞及微量样本DNA甲基化测序（Micro DNA-BS）
⑦微量cfDNA基因组甲基化测序（cfDNA-BS）
⑧（羟）甲基化DNA免疫沉淀测序（(h)MeDIP-seq/5hmC-Seal）
(1) 全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS）
全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS）可以在全基因组范围内精确的检测所有单个胞嘧啶碱基（C碱基）的甲基化水平，是DNA甲基化研究的金标准。WGBS能为基因组DNA甲基化时空特异性修饰的研究提供重要技术支持，能广泛应用在个体发育、衰老和疾病等生命过程的机制研究中，也是各物种甲基化图谱研究的首选方法。
全基因组甲基化测序技术通过T4-DNA连接酶，在超声波打断基因组DNA片段的两端连接接头序列，连接产物通过重亚硫酸盐处理将未甲基化修饰的胞嘧啶C转变为尿嘧啶U，进而通过接头序列介导的 PCR 技术将尿嘧啶U转变为胸腺嘧啶T。
应用方向
WGBS广泛用于各种物种，要求全基因组扫描（不错过关键位点）
- 全基因组甲基化图谱课题
- 标志物筛选课题
- 小规模研究课题
技术优势
- 应用范围广：适用于所有参考基因组已知物种的甲基化研究；
- 全基因组覆盖：最大限度地获取完整的全基因组甲基化信息，精确绘制甲基化图谱；
- 单碱基分辨率：可精确分析每一个C碱基的甲基化状态。
技术指标
技术选择
考虑因素：样本类型（DNA含量与完整性）、经费、 期望检测范围、样本异质性等。
研究案例
医学方向：Whole-Genome Bisulfite Sequencing of Two Distinct Interconvertible DNA Methylomes of Mouse Embryonic Stem Cells. 两种状态的小鼠胚胎干细胞的甲基化组学研究。
背景
小鼠胚胎干细胞一般生长在含有血清的基质中，被称作血清干细胞(serum ESCs)；加两种激酶抑制因子使胚胎干细胞在无血清的情况下更能保持多能性的基态，这种干细胞称为2i干细胞(2i ESCs)；这两种状态的胚胎干细胞可以互相转化。以前这方面的甲基化研究大多基于质谱，覆盖度和研究结果有限，尚缺乏2i胚胎干细胞的甲基化组学研究。方法
利用全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS），对这两种可互相转换的小鼠胚胎干细胞进行甲基化组学研究。
结论
全面准确的检测了两种小鼠胚胎干细胞的DNA甲基化修饰并进行了系统的比较；同serum ESCs相比，雄性2iESCs全局低甲基化；在血清中，雌性ESCs跟雄性2i ESCs类似呈现全局低甲基化，而在2i ESCs状态下，甲基化水平会进一步降低。
不同状态下小鼠胚胎干细胞的甲基化修饰比较
农学方向：
Global increase in DNA methylation during orange fruitdevelopment and ripening（甜橙果实发育和成熟过程中全基因组DNA甲基化增加）
背景
DNA甲基化是参与许多生物过程的重要表观遗传标记。已有研究表明，番茄在成熟过程中全基因组DNA甲基化会显著降低，但其他水果的成熟是否与全基因组DNA去甲基化有关还尚不清楚。方法纽荷尔甜橙(Citrus Sinensis Osbeck)果实，采集了开花后90、120、150、180和210d的五个不同发育阶段的果实。采集橙果皮，并保存在-80°C，用于DNA和RNA的提取。结论作者鉴定了甜橙果实的单碱基分辨DNA甲基化情况。与未成熟的甜橙果实相比，成熟的甜橙果实在3万多个基因组区域获得了DNA甲基化，在大约1000个基因组区域失去DNA甲基化，这表明在甜橙果实成熟过程中全基因组DNA甲基化显著增加。DNA甲基化的增加与DNA去甲基酶基因表达的降低有关。DNA甲基化抑制剂的应用干扰了甜橙果实的成熟，这表明DNA高甲基化是甜橙果实能够正常成熟的关键。作者发现，成熟相关的DNA高甲基化与数百个基因(如光合作用基因)的抑制和数百个基因(包括与脱落酸反应有关的基因)的激活有关。作者的结果表明DNA甲基化在甜橙果实成熟过程中起着重要作用。
甜橙果实发育和成熟期间全基因组DNA甲基化增加
（2）简化基因组甲基化测序（RRBS/dRRBS/XRBS）
简化甲基化测序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing,RRBS)是利用限制性内切酶对基因组进行酶切，富集启动子及CpG岛等重要的表观调控区域并进行重亚硫酸盐测序。该技术显著提高了高CpG区域的测序深度，在CpG岛、启动子区域和增强子元件区域可以获得高精度的分辨率，是一种准确、高效、经济的DNA甲基化研究方法，在大规模临床样本的研究中具有广泛的应用前景。
为适应科研技术的需要，易基因进一步开发了可在更大区域内捕获CpG位点的双酶切RRBS(dRRBS)，可研究更广泛区域的甲基化，包括CGI shore等区域。
为助力适用低起始量DNA样本（5ng）量多维度甲基化分析，易基因开发了富集覆盖CpG岛、启动子、增强子、CTCF结合位点的甲基化靶向基因组测序方法：extended-representation bisulfite sequencing（XRBS），实现了高灵敏度和微量样本复用检测，使其具有高度可扩展性，并适用于有限的样本和单个细胞基因组CG位点覆盖高达15M以上。
应用方向
RRBS/dRRBS/XRBS广泛应用于动物，要求全基因组扫描（覆盖关键调控位点）的：
- 队列研究、疾病分子分型、临床样本的甲基化 Biomarker 筛选
- 复杂疾病及肿瘤发病机制等甲基化研究
- 模式动物发育和疾病甲基化研究
技术优势
- 起始量：100ng gDNA；
- 单碱基分辨率；
- 多样本的覆盖区域重复性可达到85%-95%、测序区域针对高CpG调控区域，数据利用率更高；
- 针对性强，成本较低；
- 基因组CG位点覆盖高达10-15M，显著优于850K芯片。
技术指标
研究案例
医学方向（项目文章）
RRBS揭示肠道对早产的快速适应涉及喂养相关的猪肠道基因DNA甲基化重编程Rapid Gut Adaptation to Preterm Birth Involves Feeding-Related DNA Methylation Reprogramming of Intestinal Genes in Pigs.
背景
早产后，未成熟的肠道功能和免疫功能必须迅速适应细菌定植和肠内喂养。但未成熟肠道的最佳饮食策略（如时间、饮食量和饮食类型）和最合适的细菌定植仍然未知。需要更好地理解未成熟肠道如何与环境因素（如营养和微生物）相互作用，以确定如何能确保早产儿对产后生活适应的早期喂养策略。
方法
作者为验证肠道表观遗传变化与早产及首次喂养时的肠道反应有关，以仔猪为模型，对早产猪和足月猪进行全肠外营养（TPN）或部分肠内喂养5天，然后用牛奶进行纯肠内喂养，直到第26天（断奶年龄）。在第0天、第5天和第26天从总共10组猪中收集肠组织，比较分析早产猪和足月猪的肠道结构、功能、微生物组、DNA甲基化和基因表达（每组n=8）。
结论
RRBS结果显示，出生时早产猪肠道出现绒毛萎缩和整体高甲基化，影响与Wnt信号通路相关基因。在生命的前5天，高甲基化相关的LBP（lipopolysaccharide binding protein）和TLR4（Toll-like receptor 4）通路基因表达明显降低，但大多数早期甲基化差异在第26天消失。直到第26天，早产猪的蔗糖酶和麦芽糖酶活性仍然降低，肠道微生物群发生改变。0-5天期间显示许多新的甲基化差异，主要表现在未提供肠内喂养（TPN喂养）的情况下。这些甲基化差异影响了与细胞代谢相关的肠道基因，包括通过启动子低甲基化增加GCK（葡萄糖激酶）表达。总之，未成熟肠道在早产后可迅速适应其基因甲基化和表达的能力，只有少数早产相关缺陷会持续到断奶。结果表明早期肠内喂养对于刺激肠道基因甲基化重编程可能很重要，从而使肠道快速适应早产环境。
图：早产猪和足月猪肠道的甲基化差异
农学方向
不同孵化温度和CO2浓度中的鸡心脏组织全基因组DNA甲基化评估
Genome-Wide Assessment of DNA Methylationin Chicken Cardiac Tissue Exposed to Different Incubation Temperatures and CO2Levels.
背景
孵化过程中的温度和CO2浓度对肉鸡的发育有着深远的影响。此前许多研究发现这些参数的差异对孵化心重 (heart weight，HW) 有显著影响。早期生活环境也被证明会影响肉鸡后期的生产性能，因此表观遗传机制可能介导环境刺激引起的长期生理变化。
方法
利用RRBS技术评估84只在两种不同蛋壳温度（EST；37.8℃和38.9℃）和三种CO2浓度（0.1%、0.4%和0.8%）下孵化的肉鸡幼体心脏组织的DNA甲基化模式，并进行差异甲基化分析。
结论
本研究利用RRBS技术验证了ABLIM2、PITX2和THRSP三个基因的甲基化和表达的协调变化，确定孵化后小鸡心脏的差异甲基化模式与孵化EST和CO2的差异有关，并且这种差异可能通过转录因子结合和基因表达的变化影响心脏的生长和发育。此外，本研究还鉴定了负责调节体温的其他器官（包括下丘脑和甲状腺）的表观遗传模式可能有助于表征调节心脏发育的温度驱动差异机制。总之，对早期生活环境影响的表观遗传特征了解可以作为未来动物表现预测因子，从而有利于动物育种。
图：RRBS绘制DNA甲基化图谱
（3）高通量单细胞甲基化测序（sc-RBS）
与常规RRBS不同，高通量单细胞甲基化测序sc-RBS由于从单个细胞输入的DNA量很少，常规方法不能保证目标DNA在最后的扩增过程中保持不变，因此sc-RBS在降损方面进行细化。易基因建立的高通量单细胞甲基化测序sc-RBS技术无需纯化，通过限制性内切酶消化、接头连接过程和在单管中转化重亚硫酸盐，是一种专注于将纯化过程中发生的损失降至最低的方法。
应用方向
1、细胞发育：生殖细胞或胚胎细胞的成熟受到特定基因表达的影响，这与DNA中的甲基化水平相关。
2、疾病相关研究：在各种疾病中（尤其癌症），具有正常细胞所不具有的DNA甲基化模式，从而导致基因表达水平的差异。
3、珍稀样本：高通量单细胞甲基化测序特别适用于难以取得的珍稀样本和细胞异质性较大的组织样本。
技术优势
- 起始量：单细胞或1-10个细胞；
- 分辨率高：单碱基分辨率；
- 细胞检测通量高：可对上百成千个单细胞进行甲基化检测
- CG覆盖位点高：CG位点覆盖可达4-8M；
- 性价比高：单个细胞检测费用低至千余元。
技术指标
研究案例
sc-RBS+RNA-seq测序揭示黄曲霉毒素B1诱导S期阻滞L02细胞肝毒性新机制Single-cell sequencing reveals novel mechanisms of Aflatoxin B1-induced hepatotoxicity in S phase-arrested L02 cells
背景大
量研究证据表明黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1 ,AFB1）诱导的毒性包括抑制细胞增殖、氧化应激、DNA损伤、细胞周期阻滞和细胞凋亡，特别是针对肝脏细胞具有强烈的毒性。但AFB1毒性的表观遗传机制目前尚不清楚，需要进一步探讨。
方法
本研究通过单细胞测序技术（scRNA-seq + sc-RBS）研究AFB1诱导S期阻滞L02细胞肝毒性机制。
结论
单细胞测序技术结果发现AFB1可诱导细胞凋亡和细胞周期S期阻滞，降低线粒体膜电位(ΔΨm)，增加活性氧(ROS)生成。通过促性腺激素释放激素受体通路，Wnt信号传导通路，TGF-β信号通路等调节DNA甲基化水平。研究结果揭示了AFB1对S期阻滞L02细胞诱导的肝毒性机制，其中DNA甲基化通过调控促性腺激素释放激素受体通路、Wnt信号传导通路和TGF-β信号通路发挥作用，为进一步研究精确毒理学提供了新的探索策略，包括靶细胞选择、多组非定向测序和通路分析。
图：基于单细胞测序结果，研究人员提出AFB1诱导的S期阻滞L02细胞肝毒性调节机制的假设
(4) 靶基因DNA甲基化测序（Target-BS）
对目标基因/CpG 位点甲基化检测，建立灵活的靶向甲基化测序技术。易基因建立的靶基因甲基化高通量测序（Target Bisulfite sequencing，Target-BS）是针对已有目标基因panel组合，运用易基因自主研发的甲基化特异性多重PCR引物设计软件，对亚硫酸盐转化后的目标基因多重扩增，建库后进行超高深度（1000X以上）甲基化精准检测。
应用方向
Target-BS广泛用于已知位点的甲基化Biomarker筛选、验证及临床转化应用
- 后续目标基因的甲基化验证
技术优势
- 多基因多重扩增，检测通量高；
- 超高深度亚硫酸盐甲基化测序，相对于传统BSP克隆测序，检测灵敏度、准确性高，可准确检测到样本中低于1%的甲基化水平；
- 样本需求量低，20ng基因组DNA可实现多基因扩增；
- 适用范围广，对基因组DNA、FFPE样本、游离cfDNA等样本均适用；
- 检测费用显著低于现有技术、快周期、超高性价比。
研究案例
Vitamin C Prevents Offspring DNA Methylation Changes Associated with Maternal Smoking in Pregnancy扩增子甲基化测序验证补充维C可减少后代因母亲妊娠期吸烟而发生的DNA甲基化变化。
背景
妊娠期吸烟可能导致婴儿出生后终生肺功能下降。此前已有不少研究描述孕妇吸烟相关的DNA甲基化变化，如在分娩时的胎盘和脐血、胎儿肺以及儿童时期的口腔上皮和血液中。本研究为确定补充维生素C是否会减少后代因母亲因妊娠期吸烟而发生的甲基化变化。
方法
对胎盘、脐带血样本和口腔样本进行靶向亚硫酸氢盐测序，然后使用亚硫酸氢盐扩增子测序对选定的脐带血差异甲基化区域进行独立验证。
结论
安慰剂组和非吸烟者组之间甲基化差异≥10%的大多数CpG（69.03%）在补充维生素C处理后，至少50%可恢复到非吸烟者水平。恢复的CpG中有相当一部分与低甲基化CpG富集程度较高的表型结果相关。
Target-BS测序覆盖的所有321个CpG是平均覆盖深度的 337 倍
(5) 精准DNA甲基化和羟甲基化测序（oxBS-seq）
羟甲基化5hmC是哺乳动物基因组上的第六碱基，在发育、衰老、神经退行性疾病、复杂疾病及肿瘤发生过程中起重要作用。DNA羟甲基化是近年发现的一种新的DNA修饰并迅速成为研究热点。随着研究的深入，发现之前被认为是检测DNA甲基化标准的重亚硫酸盐测序并不能区分DNA甲基化（5mC）和DNA羟甲基化（5hmC）。
易基因联合剑桥大学建立了化学氧化法结合重亚硫酸盐转化的测序技术（oxidative bisulfite sequencing, oxBS-seq），该技术不仅可以精确检测DNA甲基化，排除DNA羟甲基化的影响，还可以双文库结合同时单碱基分辨率精确检测DNA羟甲基化。
传统BS转化无法区分5mC和5hmC
传统的Bisulfite测序中，5hmC经过Bisulfite处理后变为CMS，CMS在测序中仍然被读作C碱基，因此不能区分5mC和5hmC。
oxBS技术原理
oxBS-seq将5hmC氧化5fC，后者可以被Bisulfite转为U，从而实现5mC的精准检测；同时，经过与常规Bisulfite结果比较可以实现对5hmC的准确检测。
技术优势
- DNA甲基化检测全新的“标准”；
- 单碱基检测DNA羟甲基化修饰；
- 多重质控标准检测氧化效率和Bisulfite转换率；
- 实验偏好性低，重复性高（R2＞0.98）；
- 易基因自主研发的甲基化特异性多重PCR引物设计软件；
- 可满足多种测序应用需求： √ 全基因组氧化甲基化测序（oxWGBS）
√ 简化基因组氧化甲基化测序（oxRRBS）
√ 目标区域靶基因氧化甲基化测序（Target-oxBS）
技术路线
技术指标
研究案例
WGBS+oxWGBS项目文章
An epigenomic landscape of cervical intraepithelial neoplasia and cervical cancer using single-base resolution methylome and hydroxymethylome. (单碱基oxBS-seq宫颈上皮内瘤变和宫颈癌进行表观遗传学研究)
背景
有许多研究表明宫颈癌的发生和进展跟异常的表观遗传修饰相关，主要包括胞嘧啶甲基化（5mC）和羟甲基化（5hmC），通过5mC/5hmC对基因表达的表观遗传调控在肿瘤发生过程中起着关键作用。然而这些研究没有绘制完整的表观基因图谱，不能从健康宫颈到宫颈上皮内瘤变（CIN）再到宫颈癌（CC）整个发病机制中区分5mC和5hmC。另外通过多组学综合分析在宫颈癌中鉴定生物标志物的报道数量十分有限。
方法
本文作者选择从健康宫颈到CIN到CC的一系列样本，进行全基因组亚硫酸氢盐测序 (WGBS-seq)、oxWGBS-seq、RNA-seq 和组蛋白修饰数据进行综合分析，以确定CC特异性的潜在表观遗传生物标记物。
结论
本研究采用oxBS-seq方法绘制从健康宫颈到CIN到CC样本在单碱基分辨率下的全基因组5mC/5hmC图谱。分析CC进展过程中DMR和DhMR区域变化趋势。GO/KEGG富集分析与DMRs相关基因 (DAGs) 和DhMRs相关基因 (DhAGs)。个性化分析DAGs和DhAGs甲基化和羟甲基化水平与基因表达的关系。多组学综合分析甲基化/羟甲基化与基因组变异的相关性。对甲基化/羟甲基化与组蛋白修饰关联分析。通过多组学分析证实了甲基化/羟甲基化与宫颈癌发生中的 CNV 无关，且甲基化/羟甲基化的发生远早于CNV。确定了八个预后相关基因，可以作为CC治疗的新靶点，这为表观遗传学在肿瘤发生和进展中的筛查诊断及预后提供了重要数据支持。
图：基于DMRs和DhMRs的功能相关基因
RRBS+oxRRBS医学方向
oxRRBS+RRBS单碱基水平检测炎症性肠炎(IBD)小鼠模型的结肠组织DNA甲基化和羟甲基化Multi-Omics Characterization of Inflammatory Bowel Disease-Induced Hyperplasia/Dysplasia in the Rag2-/-/Il10-/- Mouse Model.
背景
多项研究表明炎症性肠炎（IBD）中存在基因组DNA甲基化失调，然而对DNA羟甲基化水平变化则关注有限。此前的研究未能分别绘制5hmC和5mC这两种表观遗传标记，限制了对IBD和结直肠癌（CRC）表观遗传机制的理解。
方法
研究利用RRBS+oxRRBS分别绘制了Rag2-/-/Il10-/-H.hepaticus感染的IBD小鼠模型近端结肠组织DNA甲基化和羟甲基化图谱，进行DNA甲基化/羟甲基化差异分析和相应的转录组关联分析。
结论
本研究利用RRBS+oxRRBS技术鉴定出1606个差异甲基化区域（DMR）和3011个差异羟甲基化区域（DhMR）。这些DMR/DhMR与胃肠道疾病、炎症性疾病和癌症相关的基因重叠。研究表明慢性炎症会引发基因组甲基化和羟甲基化模式改变，肿瘤发生的关键基因表达变化，并可能导致结直肠癌发生。
图：RRBS+oxRRBS技术鉴定出1606个DMR和3011个DhMR
RRBS+oxRRBS农学项目文章
oxRRBS+RRBS揭示了牦牛下丘脑在神经调节和髓鞘形成中的表观调控作用 Genome-Wide DNA Methylation and Hydroxymethylation Changes Revealed Epigenetic Regulation of Neuromodulation and Myelination in Yak Hypothalamus.
背景
5-甲基胞嘧啶 (5mC) 和 5-羟甲基胞嘧啶 (5hmC) 都是神经发育中重要的表观遗传修饰。然而很少有研究在自然高海拔条件下鉴定动物大脑区域的全基因组5mC和5hmC模式。
方法
利用RRBS+oxRRBS鉴定牦牛和牛的大脑、脑干、小脑、下丘脑的基因组5mC和5hmC位点，绘制基因组DNA甲基化和羟甲基化图谱，并进行DNA甲基化/羟甲基化差异化分析和对应转录组的关联分析。
结论
本研究利用RRBS+oxRRBS技术发现牦牛和牛的下丘脑和其他大脑区域的5mC和5hmC存在显著差异，鉴定出差异甲基化区域（DMR）和差异羟甲基化区域（DhMR），其中大多数彼此重叠。最后，验证了DMRs和DhMRs调控的差异表达基因（DEG）可能在神经调节和髓鞘形成中发挥重要作用。总之结果表明， 5mC和5hmC介导的表观遗传调控可能广泛影响下丘脑的发育及其生物学功能，可能有助于提高高海拔条件的生理适应性。
图：利用RRBS+oxRRBS鉴定牦牛和牛下丘脑和其他大脑区域的DMR和DhMR
(6) 单细胞及微量样本DNA甲基化测序(Micro DNA-BS)
单细胞及微量样本的DNA甲基化组学研究很大程度上受制于建库技术。传统的文库构建方法或类似于基因组DNA的单细胞扩增技术很难应用到甲基化实验过程中。易基因建立了一系列微量及单细胞甲基化检测方法，可对于不同项目需求，个性化提供检测方案，在全基因组、简化基因组、靶基因等范围开展甲基化检测。
易基因建立的单细胞及微量样本DNA甲基化测序技术包括：
- 单细胞全基因组甲基化测序（scWGBS）
- 单细胞简化基因组甲基化测序（scXRBS）
- 微量样本全基因组甲基化测序（MicroDNA-WGBS）
- 微量细胞或DNA简化基因组甲基化测序（MicroDNA-XRBS）
应用方向
单细胞及微量珍稀样本的甲基化研究主要应用于肿瘤发生机制，癌症研究，胚胎植入前诊断，胚胎早期发育，生殖细胞重组，干细胞及细胞异质性等研究领域。应用的样本包括单细胞、微量细胞、微量DNA等。特别适用于难以取得的珍稀样本和细胞异质性较大的组织样本。
技术优势
1）微量细胞或单细胞全基因组甲基化测序（Micro DNA-WGBS）DNA起始量：
- 单细胞/100-1000个细胞
- 1ng基因组DNA
- 90%以上基因组CG覆盖
2）微量细胞或DNA简化基因组甲基化测序（Micro DNA-XRBS）DNA起始量：
- 1ng基因组DNA；
- 10-20M有效CG位点覆盖；
- 20G测序数据量。
技术指标
研究案例
动物研究（项目文章）
微量细胞样本Micro DNA-WGBS绘制猴子植入前胚胎发育中的DNA甲基化图谱De novo DNA methylation during monkey pre-implantation embryogenesis.
背景
可能由于技术上的限制，还没有研究揭示早期胚胎发育过程中的全基因组DNA再甲基化。
方法
利用具有超低DNA起始量（100个细胞）的微量细胞全基因组DNA甲基化测序技术（Micro DNA-WGBS）绘制灵长类动物（恒河猴，Macaca mulatta）植入前胚胎发育的全基因组甲基化图谱。
结论
本研究使用Micro DNA-WGBS对猴子早期胚胎发育过程的5mC进行单碱基分辨率、高覆盖率的甲基化分析。分析结果鉴定了发育过程中的全基因组DNA去甲基化和从头甲基化，特别是在从2细胞到8细胞阶段的过渡期间，研究首次全面阐明了DNA甲基化动力学的"兴衰"。此外，DNA甲基转移酶敲降实验表明，异常的DNA甲基化会影响灵长类动物早期胚胎的正常发育。本研究结果进一步完善了目前关于哺乳动物DNA甲基化重编程的知识体系，并为未来灵长类动物胚胎发育的研究提供了宝贵的数据资源。
图：成对比较揭示植入前胚胎发育过程中全基因组DNA去甲基化和从头甲基化
人类研究
Single-cell DNA methylome sequencing of human preimplantation embryos. 人类植入前胚胎发育的单细胞DNA甲基化组图谱。
背景
在哺乳动物基因组上，胞嘧啶（主要是CpG二连体中的胞嘧啶）在DNA甲基化酶的催化下会发生甲基化。研究显示，DNA甲基化对多个生物学过程都至关重要，如基因表达抑制、转座子转录活性调节、X染色体的失活，以及基因组印记的维持等。此前研究显示在着床前的早期胚胎发育过程中只有大规模的DNA去甲基化。而此次研究数据显示，精子和卵细胞结合受精之后，在人类早期胚胎大规模DNA去甲基化的同时，也在大量高度特异的DNA从头加甲基化，这表明在人类早期胚胎第一轮DNA甲基化组重编程过程中，全局的DNA去甲基化‘净结果’实际上是高度有序的大规模DNA去甲基化和局部DNA加甲基化两种分子过程相互拮抗产生的动态平衡的结果。
方法
利用单细胞DNA甲基化组高通量测序方法，首次在单细胞分辨率对人类植入前胚胎发育过程进行了更加深入的分析。
结论
在这篇文章中，为了进一步在单细胞水平研究DNA甲基化重编程过程的动态特征，利用单细胞全基因组DNA甲基化组高通量测序技术，对人类植入前胚胎发育的各个关键阶段进行了单细胞、单碱基分辨率的系统研究，主要发现有：（a）首次发现了人类植入前胚胎发育过程中存在大量特异性的DNA从头加甲基。（b）首次发现从二细胞胚胎阶段开始父母本基因组上的剩余甲基化水平发生逆转，在同一个单细胞中母本基因组上的剩余甲基化水平显著高于父本基因组上的剩余甲基化水平。（c）首次发现DNA甲基化在早期胚胎卵裂过程中的不对称分配可以用来追溯同一个胚胎中每个细胞的遗传谱系。
图：植入前胚胎不同发育阶段DNA甲基化的动态变化
(7) 微量cfDNA简化基因组甲基化测序(cfDNA-RBS）
cfDNA片段化严重，片段大小常在150bp左右，现有甲基化检测技术包括cfMeDIP和微量WGBS等。无法做到碱基分辨、具有抗体特异性和非特异性捕获、覆盖深度低、检测成本高等特点。常规RRBS富集约70-350bp范围酶切片段，如对于CG含量高的片段将被切割的更碎而无法检测，保留下来的片段反而是CG含量低，无甲基化信息的基因片段。
易基因研发cfDNA-RBS技术，特异性捕获CCGG位点两端的DNA，通过亚硫酸盐测序，实现高深度，单碱基分辨检测CG位点甲基化信息。DNA起始量仅需5ng，是目前肿瘤甲基化标志物检测研究的优选技术，应用场景包括肿瘤早筛、肿瘤诊断、个性化用药、实时监控、预后监测等。
应用场景
- 癌前病变的癌变预警标志物检测
- 肿瘤早期筛查标志物检测
- 肿瘤预后标志物检测
- 药物疗效预测标志物检测
技术优势
- 超低起始量：100-500ul血浆或5ng cfDNA；
- 测序覆盖度高：20G测序数据，可达10M的CG位点覆盖，涵盖CpG岛、启动子、增强子、CTCF结合位点等多种核心调控区域
- 单碱基分辨率：在其覆盖范围内可精确分析每一个C碱基的甲基化状态；
- 性价比高：成本相对于现有技术大幅降低。
技术指标
技术选择
考虑因素：样本类型（DNA含量与完整性）、经费、 期望检测范围、样本异质性等。
cfDNA提取及检测效果
a. 提取样本为比较纯的cfDNA，主带在150bp左右；b. 提取样本中含有较多gDNA污染
研究案例
全基因组cfDNA甲基化分析提高了早期乳腺癌无创诊断成像的准确性Genome-wide cell-free DNA methylation analyses improve accuracy of non-invasive diagnostic imaging for early-stage breast cancer.
背景
基于乳房X线片和超声技术的乳腺影像报告和数据系统(BI-RADS)被广泛用于乳腺癌的早期诊断，但这种方法的假阳性率较高，会导致不必要的活检，尤其是对于BI-RADS-4类的患者来说。而携带DNA甲基化信息的游离DNA(cfDNA)已经成为一种非侵入性的癌症检测方法。
方法
本研究收集了接受乳腺X线片和超声检查后活检的210例BI-RADS 4类乳腺病变女性患者。从CHCAMS的活检患者中收集了20个肿瘤样本(10个恶性和10个良性)，用于全基因组重亚硫酸盐测序(WGBS)。
结论
基于血液的全基因组DNA甲基化研究，以单碱基分辨率从良性肿瘤中检测早期乳腺癌，结果表明结合液体活检和传统的成像诊断可以通过降低假阳性率和避免不必要的损害来改进当前乳腺癌早期诊断的临床实践。
图：液体活检与传统的诊断显像相结合可以提高早期乳腺癌诊断的准确性
(8)（羟）甲基化DNA免疫沉淀测序（(h)MeDIP-seq/5hmC-Seal）
5hmC是新发现的一种的修饰碱基，由TET家族的酶通过氧化5mC产生的。5hmC不仅能够降低MeCP蛋白的甲基化结合结构域(MBD) 与甲基化DNA的亲和性，具有潜在的参与基因表达调控的转录调节功能，而且参与了DNA去甲基化过程。
羟甲基化DNA免疫沉淀测序（Hydroxymethylated DNA Immunoprecipitation Sequencing，hMeDIP-Seq）是通过运用5'-羟甲基胞嘧啶特异性抗体富集羟甲基化的DNA片段，然后结合高通量测序技术在全基因组水平上以较小的数据量，快速、高效地寻找羟甲基化区域。可广泛应用于羟甲基化与疾病关系研究以及羟甲基化在胚胎发育过程中的研究。
技术优势：
- 检测范围广：全基因组范围鉴定甲基化修饰区域；
- 针对性强：针对性检测基因组内具有甲基化修饰的区域；
- 成本低：大大降低了测序数据量，测序成本低。
研究案例：
hMeDIP-seq测序
Genome-wide analysis of 5-hydroxymethylcytosine distribution reveals its dual function in transcriptional regulation in mouse embryonic stem cells 小鼠胚胎干细胞的羟甲基化研究。
背景
研究证实TET家族蛋白可以催化5mC转化为5hmC。5mC已经被广泛研究，但对5hmC的分布和功能知道的还很少。
方法
利用hMeDIP-seq测序技术对小鼠胚胎干细胞的wild-type和Tet1-depleted type的5hmC进行研究。
结论
5hmC在转录活性高的基因的gene bodies区域和受到Polycomb抑制的发育调节因子的启动子区域；5hmC可能在基因表达调控中起着激活和抑制的双重功能。
5hmC在全基因组的分布
MeDIP-seq测序
An atlas of DNA methylomes in porcine adipose and muscle tissues.猪脂肪和肌肉组织的甲基化组
背景
研究表明表观修饰因子，特别是DNA甲基化在肥胖发生的过程中发挥重要的作用。猪作为重要的动物模型，有助于研究人的代谢和肥胖。
方法
利用MeDIP-seq测序技术对来自于3种猪的8个脂组织和2个肌肉组织，共计180个样品进行甲基化修饰检测。系统性的研究DNA甲基化和肥胖之间的关系。
结论
构建了猪脂肪和肌肉的DNA甲基化图谱，鉴定了种间、性别和组织间的差异甲基化修饰区域（DMR），启动子区域的DMR通过抑制基因的表达与肥胖的发生有高度的相关性。
图：鉴定的差异甲基化修饰区域（DMR）
以上就是目前表观遗传学研究领域常用的8种DNA甲基化测序方法，如果您不确定自己适合哪种测序方法，可联系易基因0755-28317900，为您专属设计解决方案。
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