USP7（泛素特异蛋白酶7）通过介导PHF8（组蛋白甲基化酶）的稳定性促进乳腺癌的发生
表观遗传变化包括甲基化、乙酰化、泛素化等修饰，这些修饰能在不改变基因序列的情况下影响基因执行功能。组蛋白甲基化是研究得较为深入的一种表观遗传修饰，其对真核生物的染色体形成、基因组印记、X染色体失活和基因转录调控等过程有着重要作用。此外，表观遗传变化还与许多人类疾病有关。
表观遗传的修饰已经有成熟的技术可以检测，然而这些修饰具体参与了哪些基因的调控，有着怎样的生物学意义，还需要更多研究。如何找准合适的研究方向，以最少的投入获得最可靠的结果？如果你也常常百思不得其解，那就继续往下看。
2016年5月，天津医科大学石磊教授的团队在《The Journal of Clinical Investigation》（IF=13）发表文章《Stabilization of histone demethylase PHF8 by USP7 promotes breast carcinogenesis》，详细阐述了USP7（泛素特异蛋白酶7）通过介导PHF8（组蛋白甲基化酶）的稳定性最终促进乳腺癌的发生[1]。这篇高质量的文章借助华大基因的高通量测序平台和强大的生物信息学分析能力，找到了合适的表观遗传研究方向并作出重要成果。
USP7、PHF8是什么？
表观遗传修饰还受到一系列酶的调控，既可以修饰也可以去修饰。泛素化的调控中有一种酶——泛素特异蛋白酶7（ubiquitin-specific protease 7, USP7）能催化底物脱去泛素链。通常蛋白被泛素标记后就意味着它可能会被降解，因此，USP7的去泛素化作用有利于蛋白质的稳定。在组蛋白甲基化的调控中，PHD锌指蛋白8（PHF8）是一种组蛋白赖氨酸去甲基化酶，能对组蛋白H3亚基进行去甲基化。已经知道PHF8与许多疾病的发生有关联。
该团队在研究PHF8对癌症发生发展的作用的过程中，发现诱导表达PHF8蛋白后，经SDS-PAGE电泳分离和蛋白质谱分析，发现USP7能与PHF8紧密结合，免疫共沉淀实验也证实了这一结果。
为什么USP7要与PHF8结合？
这种“亲密拥抱”其实有着更深刻的意义。考虑到USP7能对底物蛋白去泛素化进而维持蛋白的稳定性，研究者设计实验首先验证了USP7的存在与PHF8的稳定的关系。此外还设计实验验证USP7对PHF8进行了去泛素化的作用。由实验结果得到最终的结论：与PHF8结合是USP7对其进行去泛素化的结果，最终导致去泛素化的PHF8蛋白明显提高了稳定性。
图1. USP7通过去泛素化保护PHF8
A.免疫沉淀和质谱分析验证PHF8与USP7的结合；B.免疫沉淀与qPCR验证PHF8与USP7稳定性相关；C.免疫沉淀和qPCR验证USP7的去泛素化活性与PHF8稳定性相关
PHF8更稳定有什么意义？
仅仅知道USP7通过去泛素化保护PHF8免于降解只是个开始，这个现象有什么生物学意义才更值得深究。那么问题来了，下一步该研究什么，怎么研究？
当我们发现新性状，鉴定新功能时，从更宏观的层面来考量才能对这些新性状、新功能有更准确的认识。因此，高通量测序会是个不错的选择。
研究者构建了USP7/PHF8沉默的MCF-7细胞系，对这些不同的细胞系转录组进行RNA-Seq测序并进行相应的分析。结果显示PHF8沉默的细胞系中有5,680个基因的表达发生了改变，而在USP7沉默的细胞系中则有1,477个，两者共有的差异表达基因有727个。对这些差异表达的基因进行聚类分析，结果表明约2/3的差异表达基因在USP7和PHF8沉默后表达下调，因此它们有可能就是USP7和PHF8的靶标。
图2. PHF8和USP7沉默细胞系的RNA-Seq与qPCR结果
A.共表达基因的聚类分析；B.细胞循环途径若干基因的qPCR验证；C.qChIP验证PHF8靶基因
再进一步分析，代谢途径注释（KEGG pathway）结果表明这些基因参与了对细胞生长至关重要的代谢途径，其中细胞循环是最显著的途径。对该途径中的若干基因进行qPCR，证实了高通量测序的分析结果。
至此，候选的研究对象范围已经很窄，而且从经验上看，高通量分析的结果中差异最显著的基因、途径、生物学过程往往更值得研究，因此研究者选择细胞循环途径中的若干基因进行下一步分析。
如何筛选USP7/PHF8的靶标基因？
基于RNA-Seq的分析，以及qPCR验证结果，研究者认为细胞循环途径中的基因（CCNA2, TGFB2, DEPDC1B, CCNE2, BRCA1,和CP110）很有可能是USP7和PHF8的靶标，如果这些复杂的基因名字让你头晕，只要记住CCNA2就可以了。CCNA2编码一个细胞周期蛋白CyclinA2，它与错误的细胞增殖和染色体不稳定相关，已经证明不正常的CCNA2表达与多种恶性肿瘤有关联。
利用定量染色质免疫沉淀技术（quantitative chromatin immunoprecipitation, qChIP）证实PHF8能结合在CCNA2等基因的启动子区。从蛋白层面看，研究者利用免疫组化技术检测了多个癌组织样本中的USP7、PHF8和CyclinA2的表达，再用软件评估染色深度以进行表达定量，最后发现乳腺癌组织中这三者的表达量极高，而且各因素间相关性高。
为了进一步验证USP7、PHF8和CyclinA2是否真正参与了乳腺癌发生，还构建了突变小鼠进行异质瘤移植，在此不做详述。综合其他后续的验证实验，最终作者得出结论：USP7/PHF8/cyclinA2这一连续的过程最终促进了乳腺癌的发生。
综上所述，高通量测序结果为该研究团队提供了重要的研究方向上的参考，后续的实验证实了基于测序结果的推测。文章最后还有额外收获，发现USP7介导的PHF8稳定性还参与了双链DNA断裂修复。
简单回顾一下文章思路，希望对研究者们有所启发：
参考文献：
[1] Wang Q, Ma S, Song N, et al. Stabilization of histone demethylase PHF8 by USP7 promotes breast carcinogenesis[J]. The Journal of clinical investigation, 2016, 126(6),2205-2220.
