FastQC

1、下载fastqc

wget http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/fastqc_v0.11.5.zip

2、解压

unzip fastqc_v0.11.5.zip

 

3、 给予执行权限，否则执行的时候会显示没有权限

cd FastQC
chmod 755 fastqc

 

4、加入到PATH

export PATH=/home/h/FastQC/:$PATH

 

5、测试

fastqc --help

使用例子

fastqc -o ./tmp.result/fastQC/ -t 6 ./tmp.data/fastq/H1EScell-dnase-2014-GSE56869_20151208_SRR1248176_1.fq

# -o --outdir FastQC生成的报告文件的储存路径，生成的报告的文件名是根据输入来定的

# -t --threads 选择程序运行的线程数，每个线程会占用250MB内存，越多越快咯

 

 

FastQC的报告介绍

整个报告分成若干个部分。合格会有个绿色的对勾，警告是个“!”，不合格是个红色的叉子

 

基本信息

# Encoding指测序平台的版本和相应的编码版本号，这个在计算Phred反推error P的时候有用

# Total Sequences记录了输入文本的reads的数量

# Sequence length是测序的长度

# %GC是我们需要重点关注的一个指标，这个值表示的是整体序列中的GC含量，这个数值一般是物种特异的，比如人类细胞就是42%左右

 

序列测序质量统计

# 此图中的横轴是测序序列第1个碱基到第101个碱基

# 纵轴是质量得分，Q = -10*log10（error P）即20表示1%的错误率，30表示0.1%

# 图中每1个boxplot，都是该位置的所有序列的测序质量的一个统计，上面的bar是90%分位数，下面的bar是10%分位数，箱子的中间的横线是50%分位数，箱子的上边是75%分位数，下边是25%分位数

# 图中蓝色的细线是各个位置的平均值的连线

# 一般要求此图中，所有位置的10%分位数大于20，也就是我们常说的Q20过滤

# 所以上面的这个测序结果，需要把后面的87bp以后的序列切除，从而保证后续分析的正确性

# Warning 报警 如果任何碱基质量低于10，或者是任何中位数低于25

# Failure 报错 如果任何碱基质量低于5，或者是任何中位数低于20

 

每个tail测序的情况

# 横轴和之前一样，代表101个碱基的每个不同位置

# 纵轴是tail的Index编号

# 这个图主要是为了防止在测序过程中，某些tail受到不可控因素的影响而出现测序质量偏低

# 蓝色代表测序质量很高，暖色代表测序质量不高，如果某些tail出现暖色，可以在后续分析中把该tail测序的结果全部都去除

 

每条序列的测序质量统计

# 假如我测的1条序列长度为101bp，那么这101个位置每个位置Q值的平均值就是这条reads的质量值

# 该图横轴是0-40，表示Q值

# 纵轴是每个值对应的reads数目

# 我们的数据中，测序结果主要集中在高分中，证明测序质量良好！

 

GC 含量统计

# 横轴是1 - 101 bp；纵轴是百分比

# 图中四条线代表A T C G在每个位置平均含量

# 理论上来说，A和T应该相等，G和C应该相等，但是一般测序的时候，刚开始测序仪状态不稳定，很可能出现上图的情况。像这种情况，即使测序的得分很高，也需要cut开始部分的序列信息，一般像我碰到这种情况，会cut前面5bp

 

序列平均GC含量分布图

# 横轴是0 - 100%； 纵轴是每条序列GC含量对应的数量

# 蓝色的线是程序根据经验分布给出的理论值，红色是真实值，两个应该比较接近才比较好

# 当红色的线出现双峰，基本肯定是混入了其他物种的DNA序列

# 这张图中的信息良好

 

序列测序长度统计

# 每次测序仪测出来的长度在理论上应该是完全相等的，但是总会有一些偏差

# 比如此图中，101bp是主要的，但是还是有少量的100和102bp的长度，不过数量比较少，不影响后续分析

# 当测序的长度不同时，如果很严重，则表明测序仪在此次测序过程中产生的数据不可信 

 

序列Adapter

# 此图衡量的是序列中两端adapter的情况

# 如果在当时fastqc分析的时候-a选项没有内容，则默认使用图例中的四种通用adapter序列进行统计

# 本例中adapter都已经去除，如果有adapter序列没有去除干净的情况，在后续分析的时候需要先使用cutadapt软件进行去接头

 

重复短序列

# 这个图统计的是，在序列中某些特征的短序列重复出现的次数

# 我们可以看到1-8bp的时候图例中的几种短序列都出现了非常多的次数，一般来说，出现这种情况，要么是adapter没有去除干净，而又没有使用-a参数；要么就是序列本身可能重复度比较高，如建库PCR的时候出现了bias

# 对于这种情况，我的办法是可以cut掉前面的一些长度，可以试着cut 5~8bp